METAGENOMICS
Pari, awọn genomes kokoro-arun ti o ni pipade lati awọn microbiomes ni lilo ilana atẹle nanopore
Nanopore Sequencing |Metagenomics |MAGs |Yiyika jiini kokoro arun |Ifun microbiota
Awọn ifojusi
1.A aramada ọna lati jade gun awọn ajẹkù ti DNA ti a ti gbekalẹ ninu iwadi yi, eyi ti achived isediwon ti microgram ti funfun, HMW DNA o dara fun gun-ka kika lati 300 miligiramu ti otita.
2.An apejọ bisesenlo, Lathe, ti a ṣe ninu iwadi yi, ibi ti MAGs ti a jọ nipa gun kika ati atunse nipa kukuru-ka.
3.Lathe ti ṣe ayẹwo nipasẹ idapọmọra mock.7 ninu awọn kokoro arun 12 ni a ṣaṣeyọri ti kojọpọ sinu awọn contigs ẹyọkan ati 3 ni a pejọ si awọn contigs mẹrin tabi diẹ.
4.Lathe ni a tun lo si awọn ayẹwo otita, eyiti o ṣe ipilẹṣẹ 20 genomes circularized, pẹlu Prevotella copri ati oludije Cibiobacter sp., eyiti a mọ fun jijẹ ọlọrọ ni awọn eroja jiini alagbeka.
Aṣeyọri akọkọ
Ilana isediwon fun HWM DNA
Awọn ijinlẹ metagenomic ikun ti o da lori kika gigun ti pẹ lati líle ni yiyo iwuwo molikula giga (HMW) DNA lati inu otita.Ninu iwadi yii, ilana isediwon ti o da lori enzymu ni a ṣe agbekalẹ lati yago fun irẹrun lọpọlọpọ nipasẹ lilu ileke ni awọn ọna ibile.Gẹgẹbi a ṣe han ni nọmba atẹle, awọn ayẹwo ni akọkọ ṣe itọju pẹlu amulumala ti awọn enzymu, pẹlu enzymu lytic, MetaPolyzyme, ati bẹbẹ lọ lati sọ awọn odi sẹẹli dije.DNA ti a ti tu silẹ ni a fa jade nipasẹ eto Phenol-chloroform, ti o tẹle pẹlu Proteinase K ati RNase A digestion, isọdọmọ ti o da lori ọwọn ati yiyan iwọn SPRI.Ọna yii ṣakoso lati mu awọn micrograms ti HMW DNA lati 300 m ti otita, eyiti o mu awọn ibeere itẹlera kika gigun ni awọn ofin ti didara ati opoiye mejeeji.
olusin 1. HWM DNA isediwon eni
Sisan ero ti Lathe
Gẹgẹbi a ti ṣalaye ninu eeya atẹle, Lathe ni ilana ti o wa tẹlẹ ti ilana ipe ipe aise nipa lilo Guppy.Awọn apejọ kika gigun meji lẹhinna ni iṣelọpọ nipasẹ Flye ati Canu lọtọ atẹle nipa wiwa apejọ aiṣedeede ati yiyọ kuro.Awọn apejọ iha meji naa ni a dapọ pẹlu iyara.Nigbati o ba dapọ, awọn apejọ nla ni ipele megabase lẹhinna jẹ ayẹwo fun ipinpinpin.Lẹhinna, isọdọtun ipohunpo lori awọn apejọ wọnyi jẹ ilana pẹlu kika kukuru.Awọn genomes kokoro arun ti o pejọ ti wa ni ilọsiwaju fun wiwa apejọ aiṣedeede ati yiyọ kuro.
olusin 2. Eto sisan ti Lathe ijọ
Igbelewọn ti Lathe pẹlu Mock kokoro arun
Adalu awọn oriṣi ATCC 12 boṣewa ti o ni awọn mejeeji Gram-positive ati Gram-negative kokoro arun ni a gbaṣẹ lati ṣe iṣiro iṣẹ ṣiṣe ti pẹpẹ itẹlera nanopore ati Lathe ni apejọ MAG.Apapọ data 30.3 Gb jẹ ipilẹṣẹ nipasẹ pẹpẹ nanopore pẹlu N50 ti 5.9 kb.Lathe ni ilọsiwaju pupọ N50 si 1.6 si 4-agbo ni akawe si awọn irinṣẹ apejọ gigun-gigun miiran ati 2 si 9-agbo ni akawe si awọn irinṣẹ apejọ arabara.Ninu awọn genomes kokoro-arun 12, meje ni a pejọ si awọn contigs ẹyọkan (Figure 3. Circos with black dot).Mẹta diẹ sii ni a pejọ si mẹrin tabi diẹ ẹ sii contigs, ninu eyiti apejọ ti ko pe julọ ni 83% ti jiomejiini ninu contig kan.
Ṣe nọmba 3. Awọn apejọ Genome ni idapọ kokoro-arun 12 ti asọye
Ohun elo ti Lathe ni awọn ayẹwo otita
Ọna yii ni a tun lo si awọn ayẹwo otita eniyan lati le ṣe afiwe idanimọ ara-ara ati isọdọkan apejọ si awọn ọna ti o wa, awọsanma kika ati itupalẹ orisun-kukuru.Lati awọn ayẹwo mẹta ti o kan, isediwon orisun-enzymu tuntun ti pese o kere ju 1 μg fun 300 miligiramu ti ibi-iwọwọle.Ilana Nanopore ti HMW DNA wọnyi ṣe ipilẹṣẹ awọn kika gigun pẹlu N50 ti 4.7 kb, 3.0kb ati 3.0kb lẹsẹsẹ.Ni pataki, ọna lọwọlọwọ ṣe afihan agbara nla ni wiwa makirobia ni akawe si awọn ọna ti o wa.Ni ibatan ti o ga julọ oniruuru ipele-ẹya ti a fihan nibi ni akawe si kukuru-kika ati awọsanma kika.Jubẹlọ, gbogbo genera lati kukuru-kika onínọmbà, ani ojo melo lysis-sooro Giramu-rere oganisimu, won gba pada nipa ọna yi.
Ṣe nọmba 4. Awọn iyatọ Alpha ati awọn paati taxanomic ti a pinnu nipasẹ Nanopore, kukuru-ka ati awọn ọna kika-awọsanma
Lathe ti pese pupọ gun gbogbo-apejọ N50 ju kika kukuru ati apejọ awọsanma kika, laibikita igbewọle isalẹ mẹta si mẹfa ti data aise.Awọn genomes afọwọṣe ni a ṣe nipasẹ contig binning, ninu eyiti a ti pin awọn iyaworan si “didara-giga” tabi “apakan” ti o da lori pipe, ibajẹ, awọn jiini mojuto ẹda-ọkan, bbl si kukuru-ka ati kika-awọsanma.
olusin 5. Per-organism ijọ contiguity ti kọọkan ọna
Pẹlupẹlu, ọna apejọ ti o wa lọwọlọwọ ni o lagbara lati so eso ti o ni pipade, awọn genomes ipin.Ninu awọn ayẹwo otita, didara giga mẹjọ, awọn genomes ti o ni ẹyọkan ni a pejọ ati marun ninu iwọnyi ti o ṣaṣeyọri ipinsini pato.Ọna kika gigun tun ṣe afihan agbara iwunilori ni ipinnu awọn eroja atunwi ninu awọn genomes.YiyipoP. koprigenome jẹ ipilẹṣẹ nipasẹ ọna yii, eyiti a ti mọ lati ni iwọn giga ti atunwi ọkọọkan.Apejọ ti o dara julọ ti jinomisi yii nipasẹ kika kukuru ati awọsanma kika ko kọja N50 ti 130 kb, paapaa pẹlu ijinle agbegbe ti 4800X.Awọn eroja nọmba ẹda giga wọnyi ni ipinnu ni kikun nipasẹ ọna kika gigun, eyiti a rii nigbagbogbo ni awọn aaye fifọ ti awọn apejọ kukuru-kika tabi awọn apejọ awọsanma kika.Jinomisi pipade miiran ni a royin ninu iwadi yii, eyiti a gbagbọ pe o jẹ ọmọ ẹgbẹ kan ti a ṣalaye laipẹCibiobacteragbada.Fage putative marun ni a ṣe idanimọ ni apejọ pipade yii, ti o wa lati 8.5 si 65.9 kb.
Ṣe nọmba 6. Aworan ti Circos ti awọn genomes pipade ti P.copri ati Cibiobacter sp.
Itọkasi
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Pari, awọn genomes kokoro-arun ti o ni pipade lati awọn microbiomes ni lilo ilana atẹle nanopore.Imọ-ẹrọ iseda aye,38(6), 701-707.
Tekinoloji ati Ifojusi ṣe ifọkansi ni pinpin ohun elo aṣeyọri aipẹ julọ ti awọn oriṣiriṣi awọn imọ-ẹrọ ipasẹ ọna giga ni ọpọlọpọ awọn aaye iwadii ati awọn imọran didan ni apẹrẹ idanwo ati iwakusa data.
Akoko ifiweranṣẹ: Jan-07-2022