Ipari-kikun mRNA Sequencing-Nanopore

Titele RNA ti jẹ ohun elo ti ko niye fun itupalẹ itupale transcriptome.Laisi iyemeji, ilana-kika kukuru ibile ti ṣaṣeyọri ọpọlọpọ idagbasoke pataki ni ibi.Bibẹẹkọ, o nigbagbogbo pade awọn idiwọn ni awọn idamọ isoform ni kikun-ipari, iwọn, irẹjẹ PCR.

Ilana Nanopore ṣe iyatọ si ararẹ lati awọn iru ẹrọ atẹle miiran, ni pe a ka awọn nucleotides taara laisi iṣelọpọ DNA ati pe o ṣẹda kika gigun ni mewa ti kilobases.Eyi n fun ni agbara kika-jade taara lila awọn iwe afọwọkọ gigun ni kikun ati koju awọn italaya ni awọn ikẹkọ ipele isoform.

Platform:Nanopore PromethION

Ile-ikawe:cDNA-PCR

Pe wa

Awọn alaye Iṣẹ

Awọn abajade Ririnkiri

Ikẹkọ Ọran

Awọn anfani Iṣẹ

● Irẹwẹsi ọkọọkan kekere

● Ṣiṣafihan awọn ohun elo cDNA gigun-kikun

● Awọn data ti o kere julọ nilo lati bo nọmba kanna ti awọn iwe afọwọkọ

● Idanimọ ti ọpọ isoforms fun pupọ

● Iṣiro ikosile ni ipele isoform

Awọn pato Iṣẹ

Ile-ikawe

Platform

Ipese data ti a ṣeduro (Gb)

Iṣakoso didara

cDNA-PCR(Imudara Poly-A)

Nanopore PromethION P48

6 Gb/apẹẹrẹ (da lori eya)

Ipin gigun ni kikun -70%

Iwọn didara apapọ: Q10

Awọn itupalẹ bioinformatics

●Aise data processing

● Idanimọ tiransikiripiti

● Yiyan splicing

● Iṣiro ikosile ni ipele pupọ ati ipele isoform

● Ayẹwo ikosile iyatọ

● Alaye iṣẹ ati imudara (DEGs ati DETs)

Awọn ibeere Ayẹwo ati Ifijiṣẹ

Awọn ibeere Apeere:

Nucleotides:

Konc.(ng/μl)

Iye (μg)

Mimo

Otitọ

≥ 100

≥ 0.6

OD260/280 = 1.7-2.5

OD260/230 = 0.5-2.5

Lopin tabi ko si amuaradagba tabi idoti DNA ti o han lori jeli.

Fun awọn ohun ọgbin: RIN≥7.0;

Fun eranko: RIN≥7.5;

5.0≥28S/18S≥1.0;

ni opin tabi ko si igbega ipilẹ

Àsopọ̀: Ìwọ̀n(gbẹ): ≥1 g

* Fun àsopọ ti o kere ju miligiramu 5, a ṣeduro lati firanṣẹ fisinu tutunini(ninu nitrogen olomi) ayẹwo àsopọ.

Idaduro sẹẹli: Iwọn sẹẹli = 3× 10⁶- 1×10⁷

* A ṣeduro lati gbe lysate sẹẹli tio tutunini.Ni ọran ti sẹẹli yẹn kere ju 5×10 lọ⁵, Filaṣi tutunini ni nitrogen olomi ni a ṣe iṣeduro, eyiti o dara julọ fun isediwon micro.

Awọn ayẹwo ẹjẹ: Iwọn didun≥1 milimita

Niyanju Ifijiṣẹ Apeere

Apoti: tube centifuge 2 milimita (a ko ṣeduro bankanje Tin)

Ifamisi apẹẹrẹ: Ẹgbẹ+ ṣe ẹda fun apẹẹrẹ A1, A2, A3;B1, B2, B3......

Sowo: 2, Gbẹ-yinyin: Awọn ayẹwo nilo lati wa ni aba ti ni baagi ati ki o sin ni gbẹ-yinyin.

Awọn tubes RNAstable: Awọn ayẹwo RNA le gbẹ ni tube imuduro RNA (fun apẹẹrẹ RNAstable®) ati gbigbe ni iwọn otutu yara.

Sisan Iṣẹ Iṣẹ

Nucleotides:

Ifijiṣẹ apẹẹrẹ

Ikole ìkàwé

Titele

Itupalẹ data

Lẹhin-tita awọn iṣẹ

Sisan Iṣẹ Iṣẹ

Àsopọ̀:

Apẹrẹ adanwo

Ifijiṣẹ apẹẹrẹ

RNA isediwon

Ikole ìkàwé

Titele

Itupalẹ data

Lẹhin-tita awọn iṣẹ

Ti tẹlẹ: Ipari mRNA ni kikun -PacBio

Itele: 10x Genomics Visium Spatial Transcriptome

1.Iyatọ ikosile onínọmbà -Volcano Idite

Itupalẹ ikosile iyatọ le ṣe ilana ni ipele jiini mejeeji lati ṣe idanimọ awọn jiini ti o yatọ (DEGs) ati ni ipele isoform lati ṣe idanimọ iyatọ.

3(1)

awọn iwe afọwọkọ ti a fihan (DETs)

2.Mapu igbona ikojọpọ akosoagbasomode

3.Alternative splicing idanimọ ati classification

Awọn oriṣi marun ti awọn iṣẹlẹ splicing yiyan le jẹ asọtẹlẹ nipasẹ Astalavista.

4.Idamọ awọn iṣẹlẹ poly-adenylation (APA) ati Motif ni 50 bp ni oke ti poly-A

BMK nla

Idanimọ pipọ yiyan ati iwọn-ipele isoformi nipasẹ nanopore ipari-ipari tiranscriptome titọka

Atejade:Awọn ibaraẹnisọrọ Iseda, 2020

Ilana ilana-tẹle:

Iṣakojọpọ: 1. CLL-SF3B1 (WT);2. CLL-SF3B1 (K700E iyipada);3. Deede B-ẹyin

Ilana ilana-tẹle: MinION 2D ikawe titele, PromethION 1D tito-ikawe;kukuru-ka data lati kanna awọn ayẹwo

Syeed ti o tẹle: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;

Awọn abajade bọtini

1.Isoform-level Yiyan splicing Identification

Awọn ọna kika gigun n funni ni agbara idanimọ ti mutant SF3B1^K700E-ayipada splice ojula ni isoform-ipele.35 yiyan 3'SSs ati 10 yiyan 5'SSs ni a rii pe o ni iyatọ pataki laarin SF3B1^K700Eati SF3B1^WT.33 ninu awọn iyipada 35 ni a ṣe awari tuntun nipasẹ awọn ọna kika gigun.

2.Isoform-level Alternative Splicing quantification

Ikosile ti idaduro intron (IR) isoforms ni SF3B1^K700Eati SF3B1^WTti ṣe iwọn ti o da lori awọn ilana nanopore, ti n ṣafihan ilana-isalẹ agbaye ti awọn isoforms IR ni SF3B1^K700E.

Itọkasi

Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Tiransikiripiti gigun ni kikun ti iyipada SF3B1 ni aisan lukimia lymphocytic onibaje ṣe afihan isọdọtun ti awọn introns idaduro[J].Awọn ibaraẹnisọrọ iseda.