METAGENOMICS
Bộ gen vi khuẩn hoàn chỉnh, khép kín từ hệ vi sinh vật bằng cách sử dụng trình tự nanopore
Trình tự Nanopore |Metagenomics |MAG |Tuần hoàn bộ gen vi khuẩn |Hệ vi sinh vật đường ruột
Điểm nổi bật
1. Một phương pháp mới để trích xuất các đoạn DNA dài đã được trình bày trong nghiên cứu này, phương pháp này đã đạt được việc chiết xuất microgram DNA HMW tinh khiết phù hợp cho việc đọc trình tự dài từ 300 mg phân
2.Một quy trình lắp ráp, Máy tiện, đã được giới thiệu trong nghiên cứu này, trong đó các MAG được lắp ráp bằng các lần đọc dài và sửa chữa bằng các lần đọc ngắn.
3. Máy tiện được đánh giá bằng hỗn hợp giả.7 trong số 12 vi khuẩn đã được tập hợp thành công thành các nhánh đơn và 3 vi khuẩn được tập hợp thành bốn nhánh trở xuống.
4. Máy tiện được tiếp tục áp dụng cho các mẫu phân, tạo ra 20 bộ gen tuần hoàn, bao gồm Prevotella copri và ứng cử viên Cibiobacter sp., được biết đến là giàu các yếu tố di truyền di động.
Thành tựu chính
Giao thức trích xuất DNA HWM
Các nghiên cứu về metagenomic ruột dựa trên trình tự đọc dài từ lâu đã gặp phải khó khăn trong việc chiết xuất DNA trọng lượng phân tử cao (HMW) từ phân .Trong nghiên cứu này, một quy trình chiết xuất dựa trên enzyme đã được giới thiệu để tránh sự cắt đứt mạnh do đập hạt trong các phương pháp truyền thống.Như được minh họa trong hình dưới đây, các mẫu trước tiên được xử lý bằng hỗn hợp enzyme, bao gồm enzyme lytic, MetaPolyzyme, v.v. để phân hủy thành tế bào.DNA giải phóng được chiết xuất bằng hệ thống Phenol-chloroform, sau đó là tiêu hóa Proteinase K và RNase A, tinh chế dựa trên cột và lựa chọn kích thước SPRI.Phương pháp này đã thu được microgram DNA HMW từ 300 m phân, đáp ứng các yêu cầu giải trình tự đọc dài cả về chất lượng và số lượng.
Hình 1. Sơ đồ tách chiết DNA HWM
Sơ đồ của máy tiện
Như được mô tả trong hình dưới đây, Máy tiện chứa quy trình xử lý cơ bản thô hiện có bằng cách sử dụng Guppy.Hai cụm đọc dài sau đó được Flye và Canu sản xuất riêng biệt, sau đó phát hiện và loại bỏ lắp ráp sai.Hai cụm con được hợp nhất với quickmerge.Sau khi hợp nhất, các tập hợp lớn ở cấp độ megabase sẽ được kiểm tra tính tuần hoàn.Sau đó, quá trình sàng lọc đồng thuận trên các hội đồng này được xử lý bằng các lần đọc ngắn.Bộ gen vi khuẩn được lắp ráp cuối cùng được xử lý để phát hiện và loại bỏ sự lắp ráp sai cuối cùng.
Hình 2. Sơ đồ lắp ráp máy tiện
Đánh giá máy tiện với hỗn hợp vi khuẩn giả
Hỗn hợp 12 loài ATCC tiêu chuẩn bao gồm cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm đã được sử dụng để đánh giá hiệu suất của nền tảng giải trình tự nanopore và Máy tiện trong lắp ráp MAG.Tổng cộng 30,3 Gb dữ liệu được tạo ra bởi nền tảng nanopore với N50 là 5,9 kb.Máy tiện đã cải thiện đáng kể việc lắp ráp N50 lên 1,6 đến 4 lần so với các công cụ lắp ráp đọc dài khác và gấp 2 đến 9 lần so với các công cụ lắp ráp lai.Trong số 12 bộ gen của vi khuẩn, bảy bộ gen được tập hợp thành các nhánh đơn lẻ (Hình 3. Vòng tròn có chấm đen).Ba nhánh nữa được tập hợp thành bốn nhánh hoặc ít hơn, trong đó tập hợp không hoàn chỉnh nhất chứa 83% bộ gen trong một nhánh duy nhất.
Hình 3. Tập hợp bộ gen trong hỗn hợp vi khuẩn 12 loài xác định
Ứng dụng của máy tiện trong mẫu phân
Phương pháp này tiếp tục được áp dụng cho các mẫu phân của con người để so sánh khả năng nhận dạng và lắp ráp sinh vật với các phương pháp hiện có, phân tích dựa trên đám mây đọc và đọc ngắn.Từ ba mẫu liên quan, phương pháp chiết dựa trên enzyme mới mang lại ít nhất 1 μg trên 300 mg khối lượng đầu vào.Trình tự nanopore của các DNA HMW này tạo ra số lần đọc dài với N50 lần lượt là 4,7 kb, 3,0kb và 3,0kb.Đáng chú ý, phương pháp hiện tại cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát hiện vi sinh vật so với các phương pháp hiện có.Sự đa dạng alpha cấp loài tương đối cao hơn đã được hiển thị ở đây so với đọc ngắn và đọc trên đám mây.Hơn nữa, tất cả các chi từ phân tích đọc ngắn, thậm chí cả các sinh vật Gram dương kháng ly giải điển hình, đều được phục hồi bằng phương pháp này.
Hình 4. Các thành phần phân loại và phân loại alpha được xác định bằng Nanopore, phương pháp đọc ngắn và đọc đám mây
Máy tiện mang lại N50 toàn bộ tổ hợp dài hơn nhiều so với tổ hợp đọc ngắn và đọc đám mây, mặc dù dữ liệu thô đầu vào thấp hơn ba đến sáu lần.Các bộ gen dự thảo được tạo ra bằng cách tạo thùng contig, trong đó các bản nháp được phân loại thành “chất lượng cao” hoặc “một phần” dựa trên tính đầy đủ, sự ô nhiễm, các gen lõi sao chép đơn, v.v. Việc lắp ráp đọc dài cho thấy tính liên tục cao hơn nhiều với chi phí thấp hơn so với để đọc ngắn và đọc trên đám mây.
Hình 5. Sự liên tục tập hợp từng sinh vật của từng phương pháp
Hơn nữa, phương pháp lắp ráp hiện tại có khả năng tạo ra các bộ gen hình tròn, khép kín.Trong các mẫu phân, tám bộ gen đơn, chất lượng cao đã được tập hợp và năm trong số này đã đạt được sự tuần hoàn chính xác.Phương pháp đọc dài cũng cho thấy khả năng ấn tượng trong việc giải quyết các yếu tố lặp đi lặp lại trong bộ gen.được thông tư hóaP. copribộ gen được tạo ra bằng phương pháp này, được biết là có trình tự lặp lại ở mức độ cao.Sự tập hợp tốt nhất của bộ gen này bằng đọc ngắn và đọc trên đám mây không bao giờ vượt quá N50 là 130 kb, ngay cả với độ sâu bao phủ 4800X.Các phần tử có số lượng bản sao cao này đã được giải quyết hoàn toàn bằng cách tiếp cận đọc dài, phương pháp này thường thấy ở các điểm đột phá của các cụm đọc ngắn hoặc đọc trên đám mây.Một bộ gen khép kín khác đã được báo cáo trong nghiên cứu này, được cho là thành viên củavi khuẩn vi khuẩnnhánh.Năm phage giả định đã được xác định trong tổ hợp khép kín này, có kích thước từ 8,5 đến 65,9 kb.
Hình 6. Sơ đồ vòng tròn của bộ gen khép kín của P.copri và Cibiobacter sp.
Thẩm quyền giải quyết
Rêu, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Bộ gen vi khuẩn hoàn chỉnh, khép kín từ hệ vi sinh vật bằng cách sử dụng trình tự nanopore.Công nghệ sinh học tự nhiên,38(6), 701-707.
Công nghệ và điểm nổi bật nhằm mục đích chia sẻ ứng dụng thành công gần đây nhất của các công nghệ giải trình tự thông lượng cao khác nhau trong các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau cũng như những ý tưởng tuyệt vời trong thiết kế thử nghiệm và khai thác dữ liệu.
Thời gian đăng: Jan-07-2022