TRANSKRIPTOMIKA
tabiat
ALOQALAR
Surunkali limfotsitik leykemiyada SF3B1 mutatsiyasining to'liq uzunlikdagi transkript tavsifi saqlanib qolgan intronlarning pastga regulyatsiyasini aniqlaydi.
To'liq metrajli transkriptlar|Nanoporlarni tartiblash|Alternativ izoform tahlili
Fon
SSF3B1 qo'shilish omilidagi omatik mutatsiyalar turli xil saraton kasalliklari, jumladan, surunkali limfotsitik leykemiya (CLL), uveal melanoma, ko'krak saratoni va boshqalar bilan bog'lanishi haqida keng ma'lumotlar berilgan. Bundan tashqari, qisqa muddatli transkriptomik tadqiqotlar SF3B1 mutatsiyalari tomonidan qo'zg'atilgan aberrant splicing naqshlarini aniqladi.Biroq, bu muqobil birlashma naqshlari bo'yicha tadqiqotlar uzoq vaqtdan beri voqealar darajasida va qisqa o'qilgan yig'ilgan transkriptlarning cheklanganligi sababli izoform darajasida bilim etishmasligi bilan cheklangan.Bu erda to'liq uzunlikdagi transkriptlarni yaratish uchun nanoporalarni sekvensiyalash platformasi joriy etildi, bu esa AS izoformlarini tekshirish imkonini berdi.
Eksperimental dizayn
Tajribalar
Guruhlash:1. CLL-SF3B1 (WT) 2. CLL-SF3B1 (K700E mutatsiyasi);3. Oddiy B-hujayralar
Ketma-ketlik strategiyasi:MinION 2D kutubxonasi ketma-ketligi, PromethION 1D kutubxonasi ketma-ketligi;bir xil namunalardan olingan qisqa muddatli ma'lumotlarni o'qish
Sequencing platformasi:ONT MinION;ONT PromethION;
Bioinformatika tahlili
Natijalar
A6 ta CLL namunasi va 3 ta B-hujayradan jami 257 million o'qish hosil qilingan.Ushbu o'qishlarning o'rtacha 30,5% to'liq metrajli transkriptlar ekanligi aniqlandi.
FRNK ning ull uzunlikdagi muqobil izoform tahlili (FLAIR) yuqori ishonchli izoformalar to'plamini yaratish uchun ishlab chiqilgan.FLAIRni quyidagicha umumlashtirish mumkin:
Nanopore o'qiydi hizalama: mos yozuvlar genomiga asoslangan umumiy transkript tuzilmasini aniqlash;
Splice birlashmasini tuzatish: izohli intronlardan, qisqa o'qilgan ma'lumotlardan intronlar yoki ikkalasidan qo'shilish joyi bilan to'g'ri ketma-ketlik xatolari (qizil);
Collapse: qo'shilish zanjirlari (birinchi o'tish to'plami) asosida vakili izoformlarni umumlashtiring.Qo'llab-quvvatlovchi o'qishlar soniga qarab yuqori ishonchli izofani tanlang (bo'sagi: 3).
Shakl 1. CLLda SF3B1 mutatsiyasi bilan bog'liq to'liq uzunlikdagi izoformlarni aniqlash uchun FLAIR tahlili
FLAIR 326 699 ta yuqori ishonchli biriktirilgan izoformlarni aniqladi, ularning 90% yangi izoformlardir.Ushbu izohsiz izoformlarning aksariyati ma'lum bo'lgan birikma birikmalarining yangi kombinatsiyasi (142,971), qolgan yangi izoformlarda esa saqlangan intron (21,700) yoki yangi ekson (3594) mavjud.
LO'qilgan ketma-ketliklar izoform darajasida mutant SF3B1-K700E - o'zgartirilgan ulanish joylarini aniqlash imkonini beradi.35 muqobil 3'SS va 10 muqobil 5'SS SF3B1-K700E va SF3B1-WT o'rtasida sezilarli darajada farqlanganligi aniqlandi.35 ta o'zgartirishdan 33 tasi uzoq o'qilgan ketma-ketliklar tomonidan yangi kashf etilgan.Nanopore ma'lumotlarida, SF3B1-K700E tomonidan o'zgartirilgan 3'SS o'rtasidagi masofaning kanonik saytlar cho'qqilarigacha taqsimlanishi -20 bp atrofida bo'lib, bu CLL qisqa o'qish ketma-ketligida xabar qilinganiga o'xshash nazorat taqsimotidan sezilarli darajada farq qiladi.ERGIC3 genining izoformlari tahlil qilindi, bu erda proksimal ulanish joyini o'z ichiga olgan yangi izoform SF3B1-K700E da ko'proq topildi.Ham proksimal, ham distal 3'SS bir nechta izoformlarni keltirib chiqaradigan AS naqshlari bilan bog'liq edi.
Shakl 2. Nanoporalarni ketma-ketlik ma'lumotlari bilan aniqlangan muqobil 3' qo'shish naqshlari
IQ hodisasidan foydalanish tahlili IR identifikatsiyasi va miqdorini aniqlashga ishonch tufayli qisqa o'qishga asoslangan tahlilda uzoq vaqt cheklangan edi.SF3B1-K700E va SF3B1-WT da IR izoformlarining ifodasi nanopora ketma-ketliklari asosida aniqlandi, bu SF3B1-K700E da IQ izoformlarining global pastga regulyatsiyasini ochib berdi.
4-rasm. Qishloq xo'jaligining intensivligi va uchta fermerlik tizimi (A va B) bo'yicha tarmoq ulanishi;Tasodifiy o'rmon tahlili (C) va qishloq xo'jaligi intensivligi va AMF kolonizatsiyasi o'rtasidagi bog'liqlik (D)
Shakl 3. Intron ijarasi hodisalari CLL SF3B1-K700E da kuchliroq tartibga solinadi.
Texnologiya
Nanoporlarni uzoq o'qish tartibi
Nanopore sequencing - bu bitta molekulali real vaqtda elektr signalini ketma-ketlashtirish texnologiyasi.
Dikki torli DNK yoki RNK biofilmga joylashtirilgan nano gözenekli oqsil bilan bog'lanadi va motor oqsili ostida ochiladi.
DNA/RNK iplari kuchlanish farqi ta'sirida ma'lum tezlikda nanopor kanali oqsilidan o'tadi.
Molekulalar kimyoviy tuzilishga ko'ra turli xil elektr signallarini hosil qiladi.
Rketma-ketlikni bir vaqtning o'zida aniqlashga asosiy qo'ng'iroq orqali erishiladi.
To'liq uzunlikdagi transkriptoma ketma-ketligini bajarish
√ Ma'lumotlarning to'yinganligi
Taqqoslanadigan ma'lumotlarning to'yinganligiga erishish uchun 7 barobar kamroq o'qish kerak.
√ Transkript tuzilmasini aniqlash
Har bir transkriptni to'liq o'qish konsensus bilan turli xil strukturaviy variantlarni aniqlash
√ Transkript darajasidagi differentsial tahlil -Qisqa o'qishlar bilan yashiringan o'zgarishlarni ko'rsating
Malumot
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV va boshqalar.Surunkali limfotsitik leykemiyada SF3B1 mutatsiyasining to'liq uzunlikdagi transkript tavsifi saqlanib qolgan intronlarning [J] pastga regulyatsiyasini aniqlaydi.Tabiat bilan aloqa.
Texnika va diqqatga sazovor joylar Turli tadqiqot sohalarida yuqori mahsuldorlikka ega ketma-ketlik texnologiyalarini eng so'nggi muvaffaqiyatli qo'llash, shuningdek, eksperimental dizayn va ma'lumotlarni qazib olish bo'yicha ajoyib g'oyalarni baham ko'rishga qaratilgan.
Yuborilgan vaqt: 2022 yil 08-yanvar