РЕЗЕКВЕНЦІЯ ПОВНОГО ГЕНОМА
Геномний моніторинг SARS-CoV-2 виявив варіант видалення Nsp1, який модулює реакцію інтерферону I типу
Нанопор |Illumina |Повторне секвенування геному |метагеноміка |RNA-Seq |Сангер
Компанія Biomarker Technologies надала технічну підтримку щодо секвенування зразків у цьому дослідженні.
Основні моменти
1. Секвенування генома SARS-CoV-2 і філогенетичний аналіз ідентифікують 35 повторюваних мутацій, включаючи 31 SNP і 4 Indels.
2. Асоціація з 117 клінічними фенотипами розкриває потенціал
важливі мутації.
∆500-532 в області кодування Nsp1 корелює з нижчим вірусним
3.навантаження і сироватковий ІФН-β.
4. Вірусні ізоляти з мутацією ∆500-532 індукують нижчий IFN-I
відповідь в інфікованих клітинах.
Експериментальний дизайн
Досягнення
1. Епідеміологічний та геномний нагляд за COVID-19
Клінічні дані були зібрані в провінції Сичуань, Китай, протягом періоду спалаху з 22 січня 2020 року по 20 лютого 2020 року. Загалом 538 випадків COVID-19 було підтверджено тестами qPCR у Сичуані, 28,8% з яких були в провінції капітал.Кількість підтверджених випадків у Сичуані зросла експоненціально, досягнувши піку 30 січня.Крім того, дані підтверджують, що соціальне дистанціювання може бути ключовим фактором у запобіганні поширенню вірусу.
Рисунок 1. Епідеміологічне дослідження COVID-19 у провінції Сичуань, Китай
2. Побудова геному SARS-CoV-2 та ідентифікація варіантів
За допомогою мультиплексної ПЛР-ампліфікації з подальшим секвенуванням нанопор було створено загалом 310 майже або частково повних геномів від 248 пацієнтів із прибл.80% геномів охоплено 10 зчитуваннями (середня глибина: 0,39 М зчитувань на зразок).
Рисунок 2. Частота кожного варіанту в сичуаньській когорті
Загалом 104 SNP та 18 Indels були ідентифіковані з геномів SARS-CoV-2, у яких 31 SNP та 4 Indeli були ідентифіковані як рекурентні генетичні варіанти.Порівнюючи їх зі 169 зразками з Уханя та з 81 391 високоякісною публічною послідовністю генома в GISAID, 29 із 35 знайдених варіантів представлені на інших континентах.Примітно, що чотири варіанти, включаючи ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 і T13243C, були виявлені лише в Сичуані та Ухані та відсутні в даних GISAID, що вказує на те, що ці варіанти, швидше за все, були імпортовані з Уханя, який відповідає вимогам подорожі пацієнтів.
Еволюційний аналіз із застосуванням методу максимальної правдоподібності (ML) і байєсівського молекулярного годинника було оброблено на 88 нових вірусах із Сичуані та 250 кураторських геномах з інших регіонів.Було виявлено, що геноми з ∆500-532 (делеції в кодуючій області Nsp1) розподілені рідко у філогенетичному дереві.Аналіз гаплотипів варіантів Nsp1 ідентифікував 5 із них із кількох міст.Ці результати свідчать про те, що ∆500-532 зустрічалися в кількох містах і могли бути імпортовані кілька разів з Уханя.
Рисунок 2. Повторювані генетичні варіанти та філогенетичний аналіз у геномах SARS-CoV-2
3. Асоціація рецидивуючих генетичних варіантів із клінічними наслідками
117 клінічних фенотипів були пов’язані зі ступенем тяжкості COVID-19, де 19 фенотипів, пов’язаних зі ступенем тяжкості, були класифіковані на важкі та неважкі ознаки.Зв’язок між цими ознаками та 35 повторюваними генетичними варіантами було візуалізовано на двокластерній тепловій карті.Ранжований аналіз збагачення, схожий на GSEA, показав, що ∆500-532 негативно корелює з ШОЕ, сироватковим IFN-β і кількістю Т-клітин CD3+CD8+ у крові.Крім того, тести qPCR показали, що пацієнти, інфіковані вірусом ∆500-532, мали найвище значення Ct, тобто найнижче вірусне навантаження.
Рисунок 3. Асоціації 35 рекурентних генетичних варіантів із клінічними фенотипами
4. Валідація клінічних фенотипів, пов'язаних з вірусною мутацією
Щоб зрозуміти вплив ∆500-532 на функції Nsp1, клітини HEK239T трансфікували плазмідами, що експресують повну довжину, WT Nsp1 і мутантні форми з делеціями.Профілі транскриптомів кожної обробленої клітини HEK239T обробляли для аналізу PCA, показуючи, що делеційні мутанти групуються відносно ближче та значно відрізняються від WT Nsp1.Гени, які були значно активізовані в мутантах, були в основному збагачені «пептидним біосинтетичним/метаболічним процесом», «біогенезом рибонуклеопротеїдного комплексу», «націлюванням білка на мембрану/ER» тощо. Крім того, дві делеції показали чітку модель експресії від WT.
Рисунок 4. Аналіз транскриптомів на клітинах HEK239T, трансфікованих WT Nsp1 і з делеціями
Вплив делецій на відповідь IFN-1 також перевіряли в дослідженні надекспресії.Було показано, що всі протестовані делеції знижують реакцію IFN-1 у трансфікованих клітинах HEK239T і A549 як на рівні транскриптому, так і на рівні білка.Цікаво, що гени зі значно зниженою регуляцією в делеціях були збагачені «захисною відповіддю на вірус», «реплікацією вірусного геному», «регуляцією транскрипції РНК-полімеразою II» та «відповіддю на інтерферон типу I».
Рисунок 5. Понижувальна регуляція сигнальних шляхів інтерферону в мутанта ∆500-532
У цьому дослідженні вплив цих делецій на вірус було додатково підтверджено дослідженнями вірусної інфекції.Віруси з певними мутантами були виділені з клінічних зразків і заражені клітинами Calu-3.Детальні результати дослідження вірусної інфекції можна прочитати в статті.
зробити:10.1016/j.chom.2021.01.015
довідка
Lin J, Tang C, Wei H та ін.Геномний моніторинг SARS-CoV-2 виявляє варіант делеції Nsp1, який модулює відповідь на інтерферон типу I [J].Клітина-господар і мікроб, 2021.
Новини та основні моменти спрямований на обмін останніми успішними випадками з Biomarker Technologies, фіксацію нових наукових досягнень, а також видатних методів, застосованих під час дослідження.
Час публікації: 06 січня 2022 р