Нанопора для секвенування мРНК повної довжини
Переваги сервісу
● Низьке зміщення послідовності
● Виявлення повнорозмірних молекул кДНК
● Для охоплення тієї ж кількості стенограм потрібно менше даних
● Ідентифікація кількох ізоформ на ген
● Кількісна оцінка експресії на рівні ізоформи
Специфікації послуги
| Бібліотека | Платформа | Рекомендований обсяг даних (Гб) | Контроль якості |
| кДНК-ПЛР (збагачена Poly-A) | Нанопор PromethION P48 | 6 Гб/зразок (залежно від виду) | Співвідношення повної довжини >70% Середній показник якості: Q10
|
Біоінформаційні аналізи
●Обробка необроблених даних
● Ідентифікація стенограми
● Альтернативний сплайсинг
● Кількісне визначення експресії на рівні гена та рівня ізоформи
● Диференціальний аналіз виразів
● Функціональні анотації та збагачення (DEG і DET)
Вимоги до зразків і доставка
Вимоги до зразків:
Нуклеотиди:
| Конц. (нг/мкл) | Кількість (мкг) | Чистота | Цілісність |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 На гелі виявлено обмежене забруднення білком або ДНК або його відсутність. | Для рослин: RIN≥7,0; Для тварин: RIN≥7,5; 5,0≥28S/18S≥1,0; обмежене підвищення або відсутність базової лінії |
Тканина: Вага (суха): ≥1 г
*Для тканини менше 5 мг ми рекомендуємо надсилати швидкозаморожений (у рідкому азоті) зразок тканини.
Суспензія клітин: кількість клітин = 3×106- 1×107
*Ми рекомендуємо відправляти заморожений лізат клітин.У випадку, якщо число клітинок менше 5×105, рекомендується швидке заморожування в рідкому азоті, що є кращим для мікроекстракції.
Зразки крові: Об'єм ≥1 мл
Рекомендована доставка зразків
Контейнер: центрифужна пробірка на 2 мл (фольга не рекомендована)
Зразок маркування: Група + копія, наприклад, A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Відвантаження: 2、Сухий лід: Зразки потрібно запакувати в мішки та закопати в сухий лід.
- Пробірки для стабілізації РНК: зразки РНК можна висушити в пробірці для стабілізації РНК (наприклад, RNAstable®) і відправити при кімнатній температурі.
Потік роботи служби
Нуклеотиди:
Доставка зразків
Будівництво бібліотеки
Секвенування
Аналіз даних
Післяпродажне обслуговування
Потік роботи служби
Тканина:
Дизайн експерименту
Доставка зразків
екстракція РНК
Будівництво бібліотеки
Секвенування
Аналіз даних
Післяпродажне обслуговування
1.Аналіз диференціального виразу - графік вулкана
Диференціальний аналіз експресії може бути оброблений як на генному рівні для ідентифікації диференціально експресованих генів (DEG), так і на рівні ізоформ для диференційної ідентифікації
експресовані транскрипти (DET)
2.Теплова карта ієрархічної кластеризації
3. Альтернативна ідентифікація та класифікація сплайсингу
Astalavista може передбачити п’ять типів альтернативних подій сплайсингу.
4.Ідентифікація подій альтернативного поліаденілювання (APA) і мотив на 50 п.о. до полі-A
Корпус БМК
Альтернативна ідентифікація сплайсингу та кількісна оцінка рівня ізоформ шляхом секвенування транскриптомів повної довжини нанопор
Опубліковано:Nature Communications, 2020
Стратегія послідовності:
Групування: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (мутація K700E);3. Нормальні В-клітини
Стратегія секвенування: секвенування бібліотеки MinION 2D, секвенування бібліотеки PromethION 1D;дані короткого зчитування з тих самих зразків
Платформа секвенування: Nanopore MinION;Нанопор PromethION;
Ключові результати
1. Ідентифікація альтернативного сплайсингу на рівні ізоформ
Послідовності тривалого зчитування дають змогу ідентифікувати мутантний SF3B1K700E-змінені місця сплайсингу на рівні ізоформи.Було виявлено, що 35 альтернативних 3′SS та 10 альтернативних 5′SS значно відрізняються між SF3B1K700Eі SF3B1WT.33 з 35 змін були нещодавно виявлені послідовностями довгострокового зчитування.
2. Кількісна оцінка альтернативного сплайсингу на рівні ізоформ
Експресія ізоформ утримання інтронів (IR) у SF3B1K700Eі SF3B1WTбули кількісно визначені на основі послідовностей нанопор, що виявило глобальне зниження рівня ІЧ-ізоформ у SF3B1K700E.
довідка
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV та ін.Характеристика повнорозмірного транскрипту мутації SF3B1 при хронічному лімфоцитарному лейкозі виявила зниження регуляції збережених інтронів [J].Комунікації природи.
