METAGENOMİK
Nano gözenek dizilimi kullanılarak mikrobiyomlardan tam, kapalı bakteri genomları
Nanogözenek Sıralaması |Metagenomik |MAG'ler |Bakteriyel genomun döngüselleştirilmesi |Bağırsak mikrobiyotresi
Öne Çıkanlar
1. Bu çalışmada uzun DNA fragmanlarını çıkarmak için yeni bir yöntem sunuldu; bu yöntem, 300 mg dışkıdan uzun süreli okuma dizilimine uygun mikrogram saf, HMW DNA'nın ekstraksiyonunu sağladı.
2. MAG'lerin uzun okumalarla birleştirildiği ve kısa okumalarla düzeltildiği bir montaj iş akışı olan Torna bu çalışmada tanıtıldı.
3.Torna deneme karışımı ile değerlendirildi.12 bakteriden 7'si tekli bitişikler halinde başarıyla birleştirildi ve 3'ü dört veya daha az bitişikler halinde birleştirildi.
4. Torna, Prevotella copri ve aday Cibiobacter sp. dahil olmak üzere 20 dairesel genom üreten dışkı örneklerine de uygulandı.Mobil genetik elementler açısından zengin olduğu biliniyordu.
Ana başarı
HWM DNA için ekstraksiyon protokolü
Uzun süredir okunan dizilemeye dayalı bağırsak metagenomik çalışmaları, dışkıdan yüksek moleküler ağırlıklı (HMW) DNA'nın çıkarılmasında uzun süredir zorluk çekiyordu.Bu çalışmada, geleneksel yöntemlerde boncuk döverek aşırı kesmeyi önlemek için enzim bazlı bir ekstraksiyon protokolü tanıtıldı.Aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi, numuneler ilk olarak hücre duvarlarını parçalamak için litik enzim, MetaPolyzyme vb. dahil olmak üzere bir enzim kokteyli ile işleme tabi tutuldu.Salınan DNA, Fenol-kloroform sistemi ile ekstre edildi, ardından Proteinaz K ve RNaz A sindirimi, kolon bazlı saflaştırma ve SPRI boyut seçimi yapıldı.Bu yöntem, hem kalite hem de miktar açısından uzun süredir okunan sıralama gereksinimlerini karşılayan 300 m dışkıdan mikrogram HMW DNA elde etmeyi başardı.
Şekil 1. HWM DNA ekstraksiyon şeması
Torna şeması akışı
Aşağıdaki şekilde açıklandığı gibi Torna, Guppy kullanan mevcut ham temel arama işlemini içerir.Daha sonra Flye ve Canu tarafından ayrı ayrı iki uzun okunan montaj üretilir ve ardından yanlış montaj tespiti ve kaldırılması yapılır.İki alt montaj hızlı birleştirme ile birleştirilir.Birleştirmenin ardından, megabaz seviyesindeki büyük düzenekler daha sonra dairesellik açısından kontrol edilir.Daha sonra bu derlemelerdeki fikir birliği iyileştirmesi kısa okumalarla işlenir.Son olarak bir araya getirilmiş bakteri genomları, yanlış birleşmenin nihai tespiti ve giderilmesi için işlenir.
Şekil 2. Torna düzeneğinin şema akışı
Torna Tezgahının sahte bakteri karışımı ile değerlendirilmesi
Nano gözenek sıralama platformunun ve Torna'nın MAG düzeneğindeki performansını değerlendirmek için hem Gram pozitif hem de Gram negatif bakterileri içeren standart bir ATCC 12 türü karışımı kullanıldı.Nanopore platformu tarafından N50 değeri 5,9 kb olan toplam 30,3 Gb veri üretildi.Torna, montaj N50'yi diğer uzun okumalı montaj araçlarıyla karşılaştırıldığında 1,6 ila 4 kat, hibrit montaj araçlarıyla karşılaştırıldığında ise 2 ila 9 kat büyük ölçüde geliştirdi.12 bakteri genomundan yedisi tek bitişikler halinde toplandı (Şekil 3. Siyah noktalı sirkler).Üç tane daha dört veya daha az bitişik halinde birleştirildi; burada en eksik düzenek, tek bir bitişikte genomun %83'ünü içeriyordu.
Şekil 3. Tanımlanmış 12 tür bakteri karışımındaki genom düzenekleri
Dışkı Örneklerinde Torna Uygulaması
Bu yöntem, organizma tanımlamasını ve düzeneğin yakınlığını mevcut yöntemlerle, okuma bulutu ve kısa okuma tabanlı analizle karşılaştırmak amacıyla insan dışkı örneklerine de uygulandı.İlgili üç örnekten, yeni enzim bazlı ekstraksiyon, 300 mg girdi kütlesi başına en az 1 μg verdi.Bu HMW DNA'nın nano gözenek dizilimi sırasıyla 4,7 kb, 3,0 kb ve 3,0 kb'lik N50 ile uzun okumalar üretti.Özellikle mevcut yöntem, mevcut yöntemlere kıyasla mikrobiyal tespitte büyük potansiyel göstermiştir.Burada kısa okuma ve okuma bulutuna kıyasla nispeten daha yüksek tür düzeyinde alfa çeşitliliği gösterilmiştir.Ayrıca, kısa okuma analizinden elde edilen tüm cinsler, hatta tipik olarak lizize dirençli Gram-pozitif organizmalar bile bu yöntemle geri kazanılmıştır.
Şekil 4. Nanopore, kısa okuma ve okuma bulutu yöntemleriyle belirlenen alfa çeşitliliği ve taksanomik bileşenler
Torna, üç ila altı kat daha düşük ham veri girişine rağmen, kısa okuma ve okuma bulutu montajından çok daha uzun N50 tam montaj sağladı.Taslak genomlar, taslakların tamlık, kontaminasyon, tek kopya çekirdek genleri vb. temel alınarak "yüksek kaliteli" veya "kısmi" olarak sınıflandırıldığı bitişik gruplama yoluyla üretildi. Uzun okuma derlemesi, karşılaştırıldığında daha düşük maliyetle çok daha yüksek bitişiklik gösterdi kısa okuma ve okuma bulutu için.
Şekil 5. Her yöntemin organizma başına montaj bitişikliği
Üstelik mevcut birleştirme yaklaşımı kapalı, dairesel genomlar üretme kapasitesine sahiptir.Dışkı örneklerinde sekiz adet yüksek kaliteli, tek bitişik genom bir araya getirildi ve bunlardan beşi tam daireselleşmeye ulaştı.Uzun okuma yaklaşımı aynı zamanda genomlardaki tekrarlayan unsurları çözme konusunda etkileyici bir kapasite gösterdi.DaireselleştirilmişP.copriYüksek derecede dizi tekrarı içerdiği bilinen bu yaklaşımla genom üretildi.Bu genomun kısa okuma ve okuma bulutu tarafından en iyi birleşimi, 4800X kapsama derinliğinde bile hiçbir zaman 130 kb'lik N50'yi aşmadı.Bu yüksek kopya sayısına sahip öğeler, genellikle kısa okuma veya okuma bulutu derlemelerinin kırılma noktalarında bulunan uzun okuma yaklaşımıyla tamamen çözüldü.Bu çalışmada yakın zamanda tanımlanan bir genomun üyesi olduğuna inanılan başka bir kapalı genom rapor edildi.Cibiobaktersınıf.Bu kapalı düzenekte 8,5 ila 65,9 kb arasında değişen beş varsayılan faj tanımlandı.
Şekil 6. P.copri ve Cibiobacter sp.'nin kapalı genomlarının Circos diyagramı.
Referans
Moss, EL, Maghini, DG ve Bhatt, AS (2020).Nano gözenek dizilimi kullanılarak mikrobiyomlardan eksiksiz, kapalı bakteri genomları.Doğa biyoteknolojisi,38(6), 701-707.
Teknoloji ve Öne Çıkanlar farklı yüksek verimli sıralama teknolojilerinin çeşitli araştırma alanlarındaki en son başarılı uygulamalarının yanı sıra deneysel tasarım ve veri madenciliğindeki parlak fikirleri paylaşmayı amaçlamaktadır.
Gönderim zamanı: Ocak-07-2022