İNSAN GENOMİĞİ
doğa genetiği
Uzun okuma dizilimi, nöronal intranükleer inklüzyon hastalığıyla ilişkili NOTCH2NLC'deki GGC tekrar genişlemelerini tanımlar
ONT yeniden sıralama |Illumina |Tüm ekzom dizilimi |CRISPR-Cas9 ONT hedefli sıralama |RNA dizisi |ONT 5mC metilasyon çağrısı
Öne Çıkanlar
1.Geniş bir NIID ailesi üzerindeki Bağlantı analiziyle iki bağlantılı bölge tanımlandı.
2.ONT tabanlı uzun okuma dizilimi ve Cas-9 aracılı zenginleştirme ONT dizilimi, NIID'nin potansiyel bir genetik nedenini keşfetti; NOTCH2NLC'nin 5′ UTR'sinde GGC tekrar genişlemeleri.Bu çalışma, insana özgü genlerdeki tekrarlanan genişlemelerin ilk kez segmental kopyalama yoluyla geliştiğini bildirdi.
3.RNA dizilimi, NOTCH2NLC'deki GGC tekrar genişleme bölgelerinin başlangıcında veya içinde anormal antisens transkriptleri ortaya çıkardı.
Arka plan
NEuronal intranükleer inklüzyon hastalığı (NIID), merkezi ve periferik sinir sistemlerinde eozinofilik hiyalin intranükleer inklüzyonların varlığı ile karakterize edilen, ilerleyici ve ölümcül bir nörodejeneratif hastalıktır.Oldukça değişken klinik bulgular, deri biyopsisi yapılıncaya kadar tanıda büyük zorluklar yaratmaktadır.Bununla birlikte, histopatolojiye dayalı yöntemler hala NIID'nin genetik olarak anlaşılmasını gerektiren yanlış teşhislerden muzdariptir.
Başarılar
Bağlantı Analizi
Short okuma dizilimine dayalı tam genom dizilimi (WGS) ve tam ekzom dizilimi (WES), büyük bir NIID ailesinde (etkilenen 13 ve etkilenmeyen 7 üye) gerçekleştirildi.Bu verilerden elde edilen SNP'ler üzerindeki bağlantı analizi yalnızca iki bağlantılı bölgeyi ortaya çıkardı: 1p36.31-p36.22'de 3,5 Mb'lik bir bölge (maksimum LOD=2,32) ve 1p22.1-q21.3'te 58,1 Mb'lik bir bölge (maksimum LOD: 4,21) ).Ancak bu bağlantılı bölgelerde hiçbir patojenik SNP veya CNV tanımlanmadı.
GGC, NOTCH2NLC'deki genişletmeleri tekrarlıyor
Nanopore bazlı sıralama, 8 aileden 13 etkilenen ve etkilenmeyen 4 üye üzerinde işlendi (etkilenen başka bir üye, Pacbio uzun okuma sıralama platformu tarafından dizilendi).Uzun süre okunan veriler, hastalıkla ilişkili GGC'nin NOTCH2NLC gen haritalamasının 5′ UTR'sinde 58.1 Mb bağlantılı bölgeye doğru genişlemeleri tekrarladığını ortaya çıkardı (Şekil 1).Bu tekrarlanan genişlemeler, RP-PCR ile test edilen 40 sporadik NIID vakasının tamamında da tanımlandı.
CNOTCH2NLC tekrarında (100 X-1,795 X) daha yüksek okuma kapsamı elde etmek için nanopore platformunda as-9 aracılı hedef dizilimi kullanıldı.Bu fikir birliği dizileri, GGC tekrar genişlemelerine ilişkin önceki bulgularla iyi bir uyum içindeydi.Ayrıca {(GGA)n (GGC)n}n tekrarın, zayıflık baskın fenotip için potansiyel bir genetik belirteç olduğu belirlendi (Şekil 2).
Şekil 1. NOTCH2NLC izoformlarının ekson 1'inde tanımlanan hastalıkla ilişkili tekrar genişlemesi.
Şekil 2. Zayıflık baskın fenotipi olan(*) olan veya olmayan NIID hastalarında NPTCH2NLC tekrarının fikir birliği dizileri
NOTCH2NL genleri, insan beyni evriminde ve nörolojik hastalıklarda hayati rol oynadığına inanılan, insana özgü genlerdir.Bununla birlikte, >%99,1 sekans özdeşliğine sahip üç NOTCH2 ile ilgili gen (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB ve NOTCH2NLC), en son insan genom derlemesine kadar çözülmedi.Nanopore platformunda sentez gerektirmeyen ve uzun süre okunan sıralama, yüksek benzerliğe sahip bölgelerin çözülmesinde ve %100 GC açısından zengin (GGC)n tekrarlarında dikkate değer avantajlar göstermiştir.
GGC, NOTCH2NLC'deki genişletmeleri tekrarlıyor
TRanscriptome dizilimi, etkilenen 2 ve etkilenmeyen 2 üye üzerinde işlendi.Normalleştirilmiş okuma derinliği, NOTCH2NL paraloglarının ilk eksonlarının yukarısındaki duyu ve antisens şeritleri üzerinde hesaplandı.Anormal anti-sens transkriptleri yalnızca tekrar genişleme bölgesinin başlangıcında veya içinde bulunan etkilenen vakalarda bulundu (Şekil 3'te F1-14 ve F1-16'da mor zirveler).Ayrıca 54 derece tanımlanmış ve hepsi nöronal fonksiyonlarla ilgili GO ve MPO terimleri açısından zenginleştirilmiştir.
Şekil 3. Etkilenmemiş (yukarıda) ve etkilenmiş (aşağıda) durumlarda NOTCH2NLC'nin ilk eksonunun yukarı akışında normalleştirilmiş okuma derinliği.
Teknoloji
Oxford Nanopore Teknolojileri (ONT)
NAnopor dizilimi, nükleotidlerin DNA sentezi işlemi olmadan doğrudan okunmasıyla kendisini diğer dizileme platformlarından ayırır.Tek iplikçikli bir DNA, nano boyutlu bir protein gözeneğinden (nanogözenek) geçerken, farklı nükleotitler, yakalanıp baz dizisine aktarılabilen farklı iyonik akımlar üretir.ONT dizileme platformunun kendisi, DNA okumasının uzunluğu konusunda belirgin bir teknik sınır göstermiyor.Bu nedenle, yüksek kalitede genom derlemesi için Ultra uzun okumalar (ULR'ler) mevcuttur.Üstelik, karmaşık dizi özelliklerini veya yapısal varyasyonu aşacak kadar uzun olan bu son derece uzun okumalar, burada kısa okumalı sıralamanın sınırlamalarının aşılmasına yardımcı olur.
Nanogözenek dizilimi
Yapı varyasyonu (SV) tanımlama
Ssentez gerektirmeyen sıralama, şablondaki DNA metilasyon bilgisini büyük ölçüde korudu.Metillenmiş A, T, C ve G, metillenmemiş olanlardan farklı iyonik akımlar üretir ve bunlar doğrudan platform tarafından okunabilir.Nanopore dizilimi, tek nükleotid çözünürlükte hem 5mC hem de 6mA'nın tüm genom profilini çıkarmaya olanak sağlar.
Referans
Jun Sone ve diğerleri.al.Uzun okuma dizilimi, nöronal intranükleer inklüzyon hastalığıyla ilişkili NOTCH2NLC'deki GGC tekrar genişlemelerini tanımlar.Doğa Genetiği (2019)
Teknoloji ve Öne Çıkanlar farklı yüksek verimli sıralama teknolojilerinin çeşitli araştırma alanlarındaki en son başarılı uygulamalarının yanı sıra deneysel tasarım ve veri madenciliğindeki parlak fikirleri paylaşmayı amaçlamaktadır.
Gönderim zamanı: Ocak-06-2022