METAGENOMICS
Kumpleto, saradong bacterial genome mula sa microbiome gamit ang nanopore sequencing
Nanopore Sequencing |Metagenomics |Mga MAG |Bacterial genome circularization |Microbiota sa bituka
Mga highlight
1. Isang nobelang paraan upang kunin ang mahahabang fragment ng DNA ay ipinakita sa pag-aaral na ito, na nakamit ang pagkuha ng microgram ng purong, HMW DNA na angkop para sa matagal nang nabasa na pagkakasunud-sunod mula sa 300 mg ng dumi.
2. Isang assembly workflow, Lathe, ang ipinakilala sa pag-aaral na ito, kung saan ang mga MAG ay binuo sa pamamagitan ng mahahabang pagbabasa at itinatama ng mga maikling-read.
3. Ang lathe ay nasuri sa pamamagitan ng mock mix.7 sa 12 bacteria ang matagumpay na na-assemble sa iisang contigs at 3 ang na-assemble sa apat o mas kaunting contigs.
4. Ang lathe ay higit pang inilapat sa mga sample ng dumi, na nakabuo ng 20 circularized genome, kabilang ang Prevotella copri at candidate Cibiobacter sp., na kilala sa pagiging mayaman sa mga mobile genetic na elemento.
Pangunahing Achievement
Extraction protocol para sa HWM DNA
Matagal nang nagdusa mula sa katigasan sa pagkuha ng high molecular weight(HMW) na DNA mula sa dumi ng tao.Sa pag-aaral na ito, isang enzyme-based extraction protocol ang ipinakilala upang maiwasan ang malawakang paggugupit sa pamamagitan ng bead beating sa mga tradisyonal na pamamaraan.Tulad ng ipinapakita sa sumusunod na figure, ang mga sample ay unang ginagamot ng isang cocktail ng mga enzyme, kabilang ang lytic enzyme, MetaPolyzyme, atbp. upang pababain ang mga cell wall.Ang pinakawalan na DNA ay nakuha ng Phenol-chloroform system, na sinusundan ng Proteinase K at RNase A digestion, column-based purification at SPRI size selection.Ang pamamaraang ito ay nakapagbigay ng micrograms ng HMW DNA mula sa 300 m ng dumi, na tumutupad sa matagal nang nabasa na mga kinakailangan sa pagkakasunud-sunod sa mga tuntunin ng parehong kalidad at dami.
Larawan 1. HWM DNA extraction scheme
Scheme flow ng Lathe
Gaya ng inilarawan sa sumusunod na figure, ang Lathe ay naglalaman ng umiiral na proseso ng raw basecalling process gamit ang Guppy.Dalawang matagal nang nabasang asembliya ang ginawa ng Flye at Canu nang magkahiwalay na sinusundan ng pagtuklas at pagtanggal ng maling pagpupulong.Ang dalawang sub-assemblies ay pinagsama sa quickmerge.Sa pagsasama, ang malalaking assemblies sa antas ng megabase ay susuriin para sa circularization.Kasunod nito, pinoproseso ang consensus refinement sa mga assemblies na ito sa pamamagitan ng maikling pagbabasa.Pinoproseso ang panghuling pinagsama-samang bacterial genome para sa panghuling pagtuklas at pagtanggal ng maling pagpupulong.
Figure 2. Scheme flow ng Lathe assembly
Pagsusuri ng Lathe na may mock bacteria mixture
Ang isang karaniwang ATCC 12-species mixture na binubuo ng parehong Gram-positive at Gram-negative na bacteria ay ginamit upang suriin ang pagganap ng nanopore sequencing platform at Lathe sa MAG assembly.Isang kabuuan ng 30.3 Gb na data ang nabuo ng nanopore platform na may N50 na 5.9 kb.Ang lathe ay higit na napabuti ang assembly N50 sa 1.6 hanggang 4 na beses kumpara sa iba pang matagal nang nabasa na mga kagamitan sa pagpupulong at 2 hanggang 9 na beses kumpara sa hybridd assembly tools.Sa 12 bacterial genome, pito ang na-assemble sa iisang contigs (Figure 3. Circos na may itim na tuldok).Tatlo pa ang natipon sa apat o mas kaunting contigs, kung saan ang pinaka hindi kumpletong pagpupulong ay naglalaman ng 83% ng genome sa isang solong contig.
Figure 3. Genome assemblies sa isang tinukoy na 12-species na bacterial mixture
Paglalapat ng Lathe sa mga sample ng dumi
Ang pamamaraang ito ay higit pang inilapat sa mga sample ng dumi ng tao upang maihambing ang pagkakakilanlan ng organismo at pagkakadikit ng pagpupulong sa mga umiiral na pamamaraan, read-cloud at short-read based na pagsusuri.Mula sa tatlong mga sample na kasangkot, ang bagong enzyme-based extraction ay nagbunga ng hindi bababa sa 1 μg bawat 300 mg ng input mass.Ang pagkakasunud-sunod ng Nanopore ng mga HMW DNA na ito ay nakabuo ng mahabang pagbabasa na may N50 na 4.7 kb, 3.0kb at 3.0kb ayon sa pagkakabanggit.Kapansin-pansin, ang kasalukuyang pamamaraan ay nagpakita ng malaking potensyal sa pagtuklas ng microbial kumpara sa mga umiiral na pamamaraan.Ang medyo mas mataas na pagkakaiba-iba ng alpha sa antas ng species ay ipinakita dito kumpara sa short-read at read-cloud.Bukod dito, ang lahat ng genera mula sa maikling-read analysis, kahit na karaniwang lumalaban sa lysis na Gram-positive na mga organismo, ay nakuhang muli ng pamamaraang ito.
Figure 4. Alpha diversity at taxanomic component na tinutukoy ng Nanopore, short-read at read-cloud na mga pamamaraan
Ang lathe ay nagbunga ng mas mahabang whole-assembly na N50 kaysa sa short-read at read-cloud assembly, sa kabila ng tatlo hanggang anim na beses na mas mababang input ng raw data.Ang mga draft na genome ay ginawa sa pamamagitan ng contig binning, kung saan ang mga draft ay inuri sa "mataas na kalidad" o "partial" batay sa pagkakumpleto, kontaminasyon, single-copy core genes, atbp. Ang matagal na nabasang pagpupulong ay nagpakita ng mas mataas na pagkakaugnay sa mas mababang gastos kumpara sa short-read at read-cloud.
Figure 5. Per-organism assembly contiguity ng bawat paraan
Bukod dito, ang kasalukuyang diskarte sa pagpupulong ay may kakayahang magbunga ng sarado, pabilog na mga genome.Sa mga sample ng dumi, walong de-kalidad, single-contig genome ang naipon at lima sa mga ito ang nakamit ang percise circularization.Ang long-read approach ay nagpakita rin ng kahanga-hangang kapasidad sa paglutas ng mga paulit-ulit na elemento sa mga genome.CircularizedP. coprigenome ay nabuo sa pamamagitan ng diskarteng ito, na kilala na naglalaman ng mataas na antas ng pag-uulit ng pagkakasunud-sunod.Ang pinakamahusay na pag-assemble ng genome na ito sa pamamagitan ng short-read at read-cloud ay hindi kailanman lumampas sa N50 na 130 kb, kahit na may lalim na saklaw na 4800X.Ang mga elemento ng mataas na numero ng kopya na ito ay ganap na nalutas sa pamamagitan ng long-read na diskarte, na kadalasang matatagpuan sa mga break na punto ng short-read o read-cloud na mga assemblies.Ang isa pang saradong genome ay iniulat sa pag-aaral na ito, na pinaniniwalaan na isang miyembro ng kamakailang inilarawanCibiobacterclade.Limang putative phage ang nakilala sa closed assembly na ito, mula 8.5 hanggang 65.9 kb.
Figure 6. Circos diagram ng mga closed genome ng P.copri at Cibiobacter sp.
Sanggunian
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Kumpleto, saradong bacterial genome mula sa microbiome gamit ang nanopore sequencing.Bioteknolohiya ng kalikasan,38(6), 701-707.
Tech at Highlight naglalayong ibahagi ang pinakahuling matagumpay na aplikasyon ng iba't ibang high-throughput na teknolohiya sa pagkakasunud-sunod sa iba't ibang arena ng pananaliksik pati na rin ang mga mahuhusay na ideya sa eksperimental na disenyo at data mining .
Oras ng post: Ene-07-2022