HUMAN GENOMICS
genetika ng kalikasan
Tinutukoy ng long-read sequencing ang mga umuulit na pagpapalawak ng GGC sa NOTCH2NLC na nauugnay sa neuronal intranuclear inclusion disease
ONT resequencing |Illumina |Buong exome sequencing |CRISPR-Cas9 ONT na naka-target na sequencing |RNA-seq |ONT 5mC methylation calling
Mga highlight
1.Sa pamamagitan ng Linkage analysis sa isang malaking pamilya ng NIID, dalawang naka-link na rehiyon ang natukoy.
2.ONT-based long-read sequencing at Cas-9 mediated enrichment Natuklasan ng ONT sequencing ang isang potensyal na genetic na sanhi ng NIID, GGC repeat expansions sa 5′ UTR ng NOTCH2NLC.Ang pag-aaral na ito ay nag-ulat ng mga paulit-ulit na pagpapalawak sa mga gene na partikular sa tao sa unang pagkakataon na umunlad sa pamamagitan ng mga segmental na duplikasyon.
3. Ang pagkakasunud-sunod ng RNA ay nagsiwalat ng mga abnormal na antisense transcript sa simula o sa loob ng mga rehiyon ng umuulit na pagpapalawak ng GGC sa NOTCH2NLC.
Background
NAng euronal intranuclear inclusion disease (NIID) ay isang progresibo at nakamamatay na sakit na neurodegenerative, na nailalarawan sa pagkakaroon ng eosinophilic hyaline intranuclear inclusions sa central at peripheral nervous system.Ang mataas na pabagu-bagong clinical manifestations nito ay nagpapataas ng malaking kahirapan sa diagnosis hanggang sa pagpapakilala ng skin biopsy.Gayunpaman, ang mga pamamaraan na nakabatay sa histopathology ay dumaranas pa rin ng maling pagsusuri, na humihiling ng genetic na pag-unawa sa NIID.
Mga nagawa
Pagsusuri ng Linkage
SAng hort-read sequencing batay sa buong genome sequencing (WGS) at buong exome sequencing (WES) ay isinagawa sa isang malaking pamilya ng NIID (13 apektado at 7 hindi apektadong miyembro).Ang pagsusuri ng linkage sa mga SNP na kinuha mula sa data na ito ay nagsiwalat lamang ng dalawang naka-link na rehiyon: isang 3.5 Mb na rehiyon sa 1p36.31-p36.22 (maximum LOD=2.32) at isang 58.1 Mb na rehiyon sa 1p22.1-q21.3 (maximum LOD: 4.21 ).Gayunpaman, walang mga pathogenic na SNP o CNV ang natukoy sa mga naka-link na rehiyon na ito.
Mga umuulit na pagpapalawak ng GGC sa NOTCH2NLC
NAng pagkakasunud-sunod na nakabatay sa anopore ay naproseso sa 13 apektado at 4 na hindi apektadong miyembro mula sa 8 pamilya (isa pang apektadong miyembro ay na-sequence ng Pacbio long read sequencing platform.).Ang matagal na nabasa na data ay nagsiwalat ng sakit na nauugnay sa mga pag-uulit ng GGC sa 5′ UTR ng NOTCH2NLC gene mapping sa 58.1 Mb na naka-link na rehiyon (Larawan 1).Ang mga paulit-ulit na pagpapalawak na ito ay natukoy din sa lahat ng 40 sporadic na kaso ng NIID na sinuri ng RP-PCR.
CAng as-9 mediated target sequencing sa nanopore platform ay ginamit upang makamit ang mas mataas na read coverage sa NOTCH2NLC repeat (100 X-1,795 X).Ang mga pagkakasunud-sunod na pinagkasunduan na ito ay sumang-ayon nang mabuti sa mga nakaraang natuklasan sa mga pag-uulit ng GGC.Bukod dito, ang mga pag-uulit ng {(GGA)n (GGC)n}n ay nakilala bilang isang potensyal na genetic marker para sa weakness-dominant phenotype (Larawan 2).
Figure 1. Pagpapalawak ng paulit-ulit na nauugnay sa sakit na natukoy sa exon 1 ng NOTCH2NLC isoforms.
Figure 2. Consensus sequence ng NPTCH2NLC repeat sa mga pasyente ng NIID na may(*) o walang weakness-dominant phenotype
NAng mga gene ng OTCH2NL ay mga gene na partikular sa tao, na pinaniniwalaang gumaganap ng mahalagang papel sa ebolusyon ng utak ng tao at mga sakit na neurological.Gayunpaman, tatlong mga gene na nauugnay sa NOTCH2 (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB at NOTCH2NLC) na may> 99.1% pagkakakilanlan ng pagkakasunud-sunod ay hindi nalutas hanggang sa pinakabagong pagpupulong ng genome ng tao.Ang synthesis-free at long-read sequencing sa nanopore platform ay nagpakita ng mga kapansin-pansing bentahe sa paglutas ng mga rehiyon na may mataas na pagkakapareho at (GGC) n umuulit na may 100% GC-rich.
Mga umuulit na pagpapalawak ng GGC sa NOTCH2NLC
TAng ranscriptome sequencing ay naproseso sa 2 apektado at 2 hindi apektadong miyembro.Ang normalized read depth ay kinakalkula sa sense at antisense strands sa upstream ng mga unang exon ng NOTCH2NL paralogs.Ang mga abnormal na anti-sense na transcript ay natagpuan lamang sa mga apektadong kaso, na makikita sa simula o sa loob ng repeat expansion region (Purple peak sa F1-14 at F1-16 sa Figure 3.).Bilang karagdagan, 54 na mga DEG ang nakilala at lahat ay pinayaman sa mga termino ng GO at MPO na nauugnay sa mga pag-andar ng neuronal.
Figure 3. Normalized read depth sa upstream ng unang exon ng NOTCH2NLC sa mga hindi naapektuhan (sa itaas) at apektado (sa ibaba) na mga kaso.
Teknolohiya
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
NAng anopore sequencing ay nakikilala ang sarili nito mula sa iba pang mga sequencing platform, dahil ang mga nucleotide ay direktang binabasa nang walang proseso ng DNA synthesis.Habang ang isang solong strand na DNA ay dumadaan sa isang nano-sized na butas ng protina (nanopore), ang iba't ibang mga nucleotide ay bumubuo ng iba't ibang mga ionic na alon, na maaaring makuha at ilipat sa pagkakasunud-sunod ng mga base.Ang ONT sequencing platform mismo ay hindi nagpapakita ng maliwanag na teknikal na limitasyon sa haba ng pagbabasa ng DNA.Samakatuwid, ang mga Ultra-long reads (ULRs) ay magagamit para sa genome assembly na may mataas na kalidad.Bukod dito, ang napakahabang mga babasahin na ito, na sapat na ang haba upang tumawid sa kumplikadong mga tampok ng pagkakasunud-sunod o pagkakaiba-iba ng istruktura, ay nakakatulong na malampasan ang mga limitasyon ng maikling-pagbasa na pagkakasunud-sunod dito.
Nanopore sequencing
Structure variation (SV) identification
SAng ynthesis-free sequencing ay higit na nagpapanatili ng impormasyon sa DNA methylation sa template.Ang Methylated A, T, C at G ay bumubuo ng mga natatanging ionic na alon mula sa mga un-methylated, na direktang mababasa ng platform.Ang pagkakasunud-sunod ng nanopore ay nagbibigay ng kapangyarihan sa buong genome profiling ng parehong 5mC at 6mA sa solong-nucleotide na resolusyon.
Sanggunian
Jun Sone, et.al.Tinutukoy ng long-read sequencing ang mga umuulit na pagpapalawak ng GGC sa NOTCH2NLC na nauugnay sa neuronal intranuclear inclusion disease.Nature Genetics (2019)
Tech at Highlight naglalayong ibahagi ang pinakahuling matagumpay na aplikasyon ng iba't ibang high-throughput na teknolohiya sa pagkakasunud-sunod sa iba't ibang arena ng pananaliksik pati na rin ang mga mahuhusay na ideya sa eksperimental na disenyo at data mining .
Oras ng post: Ene-06-2022