อภิพันธุศาสตร์
จีโนมแบคทีเรียแบบปิดที่สมบูรณ์จากไมโครไบโอมโดยใช้การหาลำดับนาโนพอร์
ลำดับนาโนพอร์ |เมเทโนมิกส์ |แม็ก |วงจรจีโนมของแบคทีเรีย |จุลินทรีย์ในลำไส้
ไฮไลท์
1. นำเสนอวิธีการใหม่ในการแยกชิ้นส่วน DNA ขนาดยาวในการศึกษานี้ ซึ่งสามารถสกัด DNA HMW บริสุทธิ์ระดับไมโครกรัมได้ ซึ่งเหมาะสำหรับการหาลำดับการอ่านระยะยาวจากอุจจาระขนาด 300 มก.
2.เวิร์กโฟลว์การประกอบที่เรียกว่า Lathe ถูกนำมาใช้ในการศึกษานี้ โดยที่ MAG ถูกประกอบโดยการอ่านแบบยาว และแก้ไขโดยการอ่านแบบสั้น
3.ประเมินเครื่องกลึงด้วยเครื่องจำลองแบคทีเรีย 7 ใน 12 ตัวถูกประกอบเข้าด้วยกันเป็นก้อนเดียวได้สำเร็จ และ 3 ตัวถูกประกอบเป็นสี่ก้อนหรือน้อยกว่านั้น
4. มีการใช้เครื่องกลึงเพิ่มเติมกับตัวอย่างอุจจาระ ซึ่งสร้างจีโนมแบบวงกลมจำนวน 20 จีโนม ซึ่งรวมถึง Prevotella copri และ Cibiobacter sp.ซึ่งทราบกันว่าอุดมไปด้วยองค์ประกอบทางพันธุกรรมที่เคลื่อนที่ได้
ความสำเร็จหลัก
โปรโตคอลการสกัดสำหรับ HWM DNA
การศึกษาเกี่ยวกับเมตาจีโนมิกของลำไส้ที่มีการจัดลำดับแบบอ่านมานานได้รับความเดือดร้อนมายาวนานจากความแข็งในการสกัด DNA ที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูง (HMW) ออกจากอุจจาระในการศึกษานี้ มีการใช้ระเบียบการสกัดที่ใช้เอนไซม์เพื่อหลีกเลี่ยงการตัดเฉือนอย่างกว้างขวางโดยการตีเม็ดบีดในวิธีการดั้งเดิมดังที่แสดงในรูปต่อไปนี้ ตัวอย่างจะได้รับการบำบัดด้วยเอนไซม์ผสมกัน ซึ่งรวมถึงเอนไซม์ไลติก เมตาโพลีไซม์ ฯลฯ เพื่อลดผนังเซลล์DNA ที่ปล่อยออกมาถูกสกัดโดยระบบฟีนอล-คลอโรฟอร์ม ตามด้วยการย่อยโปรตีน Proteinase K และ RNase A การทำให้บริสุทธิ์ตามคอลัมน์ และการเลือกขนาด SPRIวิธีนี้สามารถให้ผลลัพธ์ระดับไมโครกรัมของ HMW DNA จากอุจจาระขนาด 300 ม. ซึ่งเป็นไปตามข้อกำหนดในการจัดลำดับแบบอ่านยาวทั้งในด้านคุณภาพและปริมาณ
รูปที่ 1 รูปแบบการสกัด DNA ของ HWM
แผนผังการไหลของเครื่องกลึง
ตามที่อธิบายไว้ในรูปต่อไปนี้ เครื่องกลึงประกอบด้วยกระบวนการที่มีอยู่ของกระบวนการเรียกฐานดิบโดยใช้ Guppyจากนั้น Flye และ Canu จะผลิตชุดประกอบที่อ่านยาวสองชิ้นแยกกัน ตามด้วยการตรวจจับและถอดชุดประกอบที่ไม่ถูกต้องแอสเซมบลีย่อยทั้งสองถูกรวมเข้ากับ Quickmergeเมื่อรวมเข้าด้วยกัน แอสเซมบลีขนาดใหญ่ที่ระดับเมกะเบสจะถูกตรวจสอบเพื่อหาการหมุนเวียนต่อจากนั้น การปรับปรุงฉันทามติในแอสเซมบลีเหล่านี้จะถูกประมวลผลด้วยการอ่านแบบสั้นจีโนมของแบคทีเรียที่ประกอบในขั้นสุดท้ายจะได้รับการประมวลผลเพื่อการตรวจจับและกำจัดการประกอบที่ผิดพลาดในขั้นสุดท้าย
รูปที่ 2 ผังแผนผังของชุดประกอบเครื่องกลึง
การประเมินเครื่องกลึงที่มีส่วนผสมของแบคทีเรียจำลอง
มีการใช้ส่วนผสมมาตรฐาน ATCC 12 สายพันธุ์ที่ประกอบด้วยแบคทีเรียแกรมบวกและแบคทีเรียแกรมลบเพื่อประเมินประสิทธิภาพของแพลตฟอร์มลำดับนาโนพอร์และเครื่องกลึงในการประกอบ MAGข้อมูลทั้งหมด 30.3 Gb ถูกสร้างขึ้นโดยแพลตฟอร์ม nanopore โดยมี N50 เป็น 5.9 kbเครื่องกลึงปรับปรุงการประกอบ N50 เป็น 1.6 เป็น 4 เท่าอย่างมาก เมื่อเทียบกับเครื่องมือประกอบแบบอ่านยาวอื่นๆ และ 2 ถึง 9 เท่าเมื่อเทียบกับเครื่องมือประกอบแบบไฮบริดจากจีโนมของแบคทีเรีย 12 ตัว มี 7 ตัวที่ประกอบกันเป็น contig เดี่ยว (รูปที่ 3 Circos ที่มีจุดสีดำ)มีการรวมกลุ่มอีกสามกลุ่มเข้าด้วยกันเป็นสี่กลุ่มหรือน้อยกว่านั้น โดยชุดประกอบที่ไม่สมบูรณ์ที่สุดประกอบด้วยจีโนม 83% ในกลุ่มเดียว
รูปที่ 3 การประกอบจีโนมในส่วนผสมของแบคทีเรีย 12 สายพันธุ์ที่กำหนด
การใช้เครื่องกลึงในตัวอย่างอุจจาระ
วิธีการนี้ถูกนำไปใช้เพิ่มเติมกับตัวอย่างอุจจาระของมนุษย์เพื่อเปรียบเทียบการระบุสิ่งมีชีวิตและความต่อเนื่องของการประกอบกับวิธีการที่มีอยู่ การวิเคราะห์แบบคลาวด์และการอ่านแบบสั้นจากตัวอย่างทั้งสามที่เกี่ยวข้อง การสกัดโดยใช้เอนไซม์ใหม่ให้ผลลัพธ์อย่างน้อย 1 ไมโครกรัมต่อมวลอินพุต 300 มก.การจัดลำดับนาโนพอร์ของ HMW DNA เหล่านี้สร้างการอ่านแบบยาวด้วย N50 ที่ 4.7 kb, 3.0kb และ 3.0kb ตามลำดับโดยเฉพาะอย่างยิ่ง วิธีการปัจจุบันแสดงให้เห็นถึงศักยภาพในการตรวจหาจุลินทรีย์ที่ดีเยี่ยมเมื่อเปรียบเทียบกับวิธีการที่มีอยู่ความหลากหลายอัลฟ่าระดับสปีชีส์ค่อนข้างสูงกว่าแสดงที่นี่เมื่อเปรียบเทียบกับการอ่านแบบสั้นและแบบอ่านคลาวด์ยิ่งไปกว่านั้น สกุลทั้งหมดจากการวิเคราะห์แบบอ่านสั้น แม้กระทั่งสิ่งมีชีวิตแกรมบวกที่ต้านทานการสลายโดยทั่วไป ก็ถูกกู้คืนด้วยวิธีนี้
รูปที่ 4 ความหลากหลายอัลฟ่าและองค์ประกอบการจัดอนุกรมวิธานที่กำหนดโดยวิธี Nanopore วิธีอ่านแบบสั้นและแบบอ่านคลาวด์
เครื่องกลึงให้ผลลัพธ์ N50 ทั้งแอสเซมบลียาวนานกว่าแอสเซมบลีแบบอ่านสั้นและอ่านคลาวด์ แม้ว่าอินพุตข้อมูลดิบจะน้อยกว่าสามถึงหกเท่าก็ตามจีโนมแบบร่างถูกสร้างขึ้นโดย contig binning ซึ่งแบบร่างถูกจัดประเภทเป็น "คุณภาพสูง" หรือ "บางส่วน" ตามความสมบูรณ์ การปนเปื้อน ยีนคอร์ที่มีสำเนาเดียว ฯลฯ ชุดประกอบที่อ่านยาวแสดงให้เห็นความต่อเนื่องที่สูงกว่ามากด้วยต้นทุนที่ต่ำกว่าเมื่อเทียบกับ เพื่ออ่านแบบสั้นและอ่านแบบคลาวด์
รูปที่ 5 ความต่อเนื่องของการประกอบต่อสิ่งมีชีวิตของแต่ละวิธี
นอกจากนี้วิธีการประกอบในปัจจุบันยังสามารถให้ผลผลิตจีโนมแบบวงกลมแบบปิดได้ในตัวอย่างอุจจาระ มีการรวบรวมจีโนมที่มีการเชื่อมต่อเดี่ยวคุณภาพสูงจำนวน 8 รายการ และ 5 รายการจากทั้งหมดเหล่านี้ประสบความสำเร็จในการหมุนเวียนที่แม่นยำวิธีการอ่านแบบยาวยังแสดงให้เห็นถึงความสามารถที่น่าประทับใจในการแก้ไของค์ประกอบที่ซ้ำกันในจีโนมเวียนพี. โคปรีจีโนมถูกสร้างขึ้นโดยวิธีนี้ ซึ่งเป็นที่ทราบกันว่ามีการทำซ้ำของลำดับในระดับสูงการประกอบที่ดีที่สุดของจีโนมนี้โดยการอ่านแบบสั้นและการอ่านคลาวด์จะต้องมีขนาดไม่เกิน N50 ที่ 130 kb แม้ว่าจะมีความลึกครอบคลุมถึง 4800X ก็ตามองค์ประกอบจำนวนสำเนาสูงเหล่านี้ได้รับการแก้ไขอย่างสมบูรณ์ด้วยวิธีการอ่านแบบยาว ซึ่งมักพบที่จุดแตกหักของแอสเซมบลีแบบอ่านสั้นหรือแบบอ่านคลาวด์มีรายงานจีโนมแบบปิดอีกอันในการศึกษานี้ ซึ่งเชื่อกันว่าเป็นสมาชิกของจีโนมที่อธิบายไว้เมื่อเร็ว ๆ นี้ซิไบโอแบคเตอร์เคลดฟาจสมมุติห้าตัวถูกระบุในชุดประกอบแบบปิดนี้ ซึ่งอยู่ในช่วงตั้งแต่ 8.5 ถึง 65.9 กิโลไบต์
รูปที่ 6 แผนภาพ Circos ของจีโนมแบบปิดของ P.copri และ Cibiobacter sp
อ้างอิง
มอส, เอล, มากีนี, ดีจี, และบัตต์, AS (2020)จีโนมแบคทีเรียแบบปิดที่สมบูรณ์จากไมโครไบโอมโดยใช้การหาลำดับนาโนพอร์เทคโนโลยีชีวภาพธรรมชาติ,38(6), 701-707.
เทคโนโลยีและไฮไลท์ มุ่งหวังที่จะแบ่งปันการประยุกต์ใช้เทคโนโลยีการจัดลำดับความเร็วสูงต่างๆ ที่ประสบความสำเร็จล่าสุดในขอบเขตการวิจัยต่างๆ รวมถึงแนวคิดที่ยอดเยี่ยมในการออกแบบการทดลองและการขุดข้อมูล
เวลาโพสต์: Jan-07-2022