МЕТАГЕНОМИКА
Геномҳои мукаммали бактериявии пӯшида аз микробиомаҳо бо истифода аз пайдарпайии нанопораҳо
пайдарпайии нанопора |Метагеномика |MAGs |Сиркуляризатсияи геноми бактериявӣ |Микробиоти рӯда
Нуктаҳои муҳим
1. Дар ин тадқиқот усули нави истихроҷи порчаҳои дарози ДНК пешниҳод карда шуд, ки он ба истихроҷи микрограмм ДНК-и пок, HMW барои пайдарпайии дарозмуддат аз 300 мг наҷосат мувофиқ аст.
2.Ҷараёни кори васлкунӣ, Токар, дар ин тадқиқот ҷорӣ карда шуд, ки дар он MAG-ҳо бо хондани тӯлонӣ ҷамъ карда шуданд ва бо хондани кӯтоҳ ислоҳ карда шуданд.
3.Торкар бо омехтаи тақаллубӣ баҳо дода шуд.7 аз 12 бактерия бомуваффақият ба контигҳои ягона ва 3-тоаш ба чор ё камтар аз контигҳо ҷамъ карда шуданд.
4. Токарӣ минбаъд ба намунаҳои табақ истифода бурда шуд, ки тавлидшуда 20 геномҳои даврашакл, аз ҷумла Prevotella copri ва номзад Cibiobacter sp., ки бо бой будани унсурҳои генетикии мобилӣ маълум буданд.
Муваффақияти асосӣ
Протоколи истихроҷ барои DNA HWM
Тадқиқотҳои метагеномии рӯда, ки дар асоси пайдарпай хонданд, муддати тӯлонӣ аз сахтӣ ҳангоми истихроҷи ДНК-и вазни баланди молекулавӣ (HMW) аз наҷосат азоб мекашиданд.Дар ин таҳқиқот, протоколи истихроҷи ферментҳо ҷорӣ карда шуд, то аз буридани васеъ тавассути лату кӯб бо усулҳои анъанавӣ пешгирӣ карда шавад.Тавре ки дар расми зерин нишон дода шудааст, намунаҳо аввал бо коктейл аз ферментҳо, аз ҷумла ферментҳои литикӣ, MetaPolyzyme ва ғайра коркард карда шуданд, то деворҳои ҳуҷайраҳоро вайрон кунанд.ДНК-и озодшуда тавассути системаи фенол-хлороформ истихроҷ карда шуд, пас аз он Proteinase K ва RNase A ҳозима, поксозӣ дар асоси сутун ва интихоби андозаи SPRI.Ин усул муяссар шуд, ки аз 300 м наҷосат микрограмм ДНК-и HMW ба даст орад, ки талаботҳои пайдарпайии дарозмуддатро аз ҷиҳати сифат ва миқдор иҷро мекунад.
Расми 1. Схемаи истихроҷи ДНК HWM
Схемаи чараёни станок
Тавре ки дар расми зерин тасвир шудааст, токарӣ дорои раванди мавҷудаи раванди занги хом бо истифода аз Guppy мебошад.Пас аз он ду маҷмӯаи тӯлонӣ хондашуда аз ҷониби Flye ва Canu алоҳида истеҳсол карда мешаванд ва пас аз он ошкор ва бартарафсозии нодурусти васлкунӣ анҷом дода мешаванд.Ду зерсохтор бо зудӣ якҷоя карда мешаванд.Ҳангоми муттаҳидшавӣ, маҷлисҳои калон дар сатҳи мегабаза пас аз гардиш тафтиш карда мешаванд.Баъдан, такмили консенсус дар ин маҷлисҳо бо хондани кӯтоҳ коркард карда мешавад.Геномҳои ниҳоии ҷамъшудаи бактериявӣ барои ошкор ва бартарафсозии нодурусти монтаж коркард карда мешаванд.
Расми 2. Схемаи чараёни васлкунии станок
Арзёбии станок бо омехтаи бактерияҳои тақаллубӣ
Омехтаи стандартии ATCC 12-намуд, ки ҳам бактерияҳои грам-мусбат ва ҳам грам-манфро дар бар мегирад, барои арзёбии иҷрои платформаи пайдарпайии нанопора ва токар дар василаи MAG истифода шудааст.Дар маҷмӯъ 30,3 Гб маълумот тавассути платформаи nanopore бо N50 аз 5,9 кб тавлид шудааст.Дастгоҳи токарӣ васлкунии N50-ро нисбат ба дигар асбобҳои васлкунии дурудароз аз 1,6 то 4 маротиба ва нисбат ба асбобҳои васлкунии гибридӣ 2 то 9 маротиба такмил дод.Аз 12 геномҳои бактериявӣ ҳафттоаш ба контигҳои ягона ҷамъ карда шуданд (Расми 3. Сиркоҳо бо нуқтаи сиёҳ).Се нафари дигар ба чор ё камтар аз контигҳо ҷамъ оварда шуданд, ки дар он маҷмӯи нопурра 83% геномро дар як контиг дар бар мегирад.
Расми 3. Ассотсиатсияҳои геномӣ дар омехтаи муайяни бактериявии 12-намуд
Истифодаи станок дар намунаҳои табақ
Ин усул минбаъд ба намунаҳои наҷосати инсон бо мақсади муқоисаи муайянкунии организм ва пайвастагии маҷлис бо усулҳои мавҷуда, таҳлили хониш-абр ва кӯтоҳхондан истифода карда шуд.Аз се намунаи ҷалбшуда, истихроҷи нав дар асоси фермент ҳадди аққал 1 мкг барои 300 мг массаи воридотӣ дод.Пайдарпаии нанопораҳои ин ДНК-и HMW хонишҳои дарозмуддатро бо N50 мутаносибан 4,7 кб, 3,0 кб ва 3,0 кб тавлид карданд.Қобили зикр аст, ки усули ҳозира дар муқоиса бо усулҳои мавҷуда дар муайянкунии микробҳо потенсиали калон нишон дод.Дар ин ҷо дар муқоиса бо абрҳои кӯтоҳмуддат ва хондан гуногунрангии нисбатан баландтари навъи алфа нишон дода шудааст.Гузашта аз ин, тамоми наслҳо аз таҳлили кӯтоҳмуддат, ҳатто организмҳои маъмулан ба лизис тобовар грам-мусбат, бо ин усул барқарор карда шуданд.
Тасвири 4. Гуногунии алфа ва ҷузъҳои таксаномӣ, ки бо усулҳои Nanopore, хондани кӯтоҳ ва хондан-абр муайян карда мешаванд
Токарӣ, сарфи назар аз вуруди се то шаш маротиба камтари маълумоти хом, назар ба монтажи кӯтоҳмуддат ва хондан-абр, маҷмӯи пурраи N50 хеле дарозтар дод.Лоиҳаи геномҳо бо роҳи контигбанди истеҳсол карда шуданд, ки дар он лоиҳаҳо аз рӯи мукаммалӣ, ифлосшавӣ, генҳои асосии як нусхабардорӣ ва ғайра ба “сифати баланд” ё “қисман” тасниф карда шуданд. Маҷмӯи геномҳои тӯлонӣ хониш ҳамбастагии хеле баландтарро бо арзиши камтар дар муқоиса нишон дод. ба кутоххондан ва хондан-абр.
Расми 5. Пайвастагии ҳар як метод
Гузашта аз ин, равиши ҳозираи монтаж қодир аст геномҳои пӯшида ва даврашакл ба даст орад.Дар намунаҳои наҷосат, ҳашт геномҳои баландсифати якқабата ҷамъ карда шуданд ва панҷтои онҳо гардиши дақиқро ба даст оварданд.Равиши мутолиа инчунин қобилияти таъсирбахшро дар ҳалли унсурҳои такроршаванда дар геномҳо нишон дод.ДоираҳоP. copriгеном тавассути ин равиш тавлид шудааст, ки маълум аст, ки дорои дараҷаи баланди такрори пайдарпайӣ мебошад.Беҳтарин маҷмӯаи ин геном тавассути абри кӯтоҳ ва хондан ҳеҷ гоҳ аз N50 аз 130 кб зиёд набуд, ҳатто бо умқи фарогирии 4800X.Ин унсурҳои шумораи зиёди нусхабардорӣ тавассути равиши дарозмуддати хондан, ки аксар вақт дар нуқтаҳои шикастани маҷлисҳои абрии кӯтоҳ ё хондан пайдо мешаванд, ҳал карда шуданд.Дар ин таҳқиқот боз як геноми пӯшида гузориш дода шуд, ки ба он узви ба наздикӣ тавсифшуда будCibobacterклад.Дар ин маҷлиси пӯшида панҷ фагҳои тахминӣ муайян карда шуданд, ки аз 8,5 то 65,9 кб мебошанд.
Расми 6. Диаграммаи циркоси геномҳои пӯшидаи P.copri ва Cibiobacter sp.
Истинод
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Геномҳои мукаммали бактериявии пӯшида аз микробиомаҳо бо истифода аз пайдарпайии нанопораҳо.Биотехнологияи табиат,38(6), 701-707.
Технология ва Нуктаҳо Ҳадафи мубодилаи бомуваффақияти охирини технологияҳои гуногуни пайдарпайии баландсуръат дар арсаҳои гуногуни таҳқиқот ва инчунин ғояҳои олиҷаноб дар тарҳрезии таҷрибавӣ ва истихроҷи додаҳо.
Вақти фиристодан: январ-07-2022