Bidhaa

Upangaji wa Urefu Kamili wa mRNA-Nanopore

Picha Iliyoangaziwa ya mRNA ya Urefu Kamili-Nanopore

Mfuatano wa RNA umekuwa zana yenye thamani sana kwa uchanganuzi wa kina wa nukuu.Bila shaka, mpangilio wa jadi wa kusoma kwa muda mfupi ulipata maendeleo mengi muhimu hapa.Hata hivyo, mara nyingi hukutana na vikwazo katika vitambulisho vya urefu kamili vya isoform, quantification, upendeleo wa PCR.

Mpangilio wa Nanopore hujitofautisha na majukwaa mengine ya mpangilio, kwa kuwa nyukleotidi husomwa moja kwa moja bila usanisi wa DNA na hutoa usomaji wa muda mrefu katika makumi ya kilobases.Hii huwezesha nakala za urefu kamili za kusoma moja kwa moja na kukabiliana na changamoto katika masomo ya kiwango cha isoform.

Jukwaa:Nanopore PromethION

Maktaba:cDNA-PCR

Wasiliana nasi

Maelezo ya Huduma

Matokeo ya Onyesho

Uchunguzi kifani

Faida za Huduma

● Upendeleo wa chini wa mlolongo

● Kufichua molekuli za cDNA za urefu kamili

● Data ndogo inayohitajika ili kufikia idadi sawa ya manukuu

● Utambulisho wa isoform nyingi kwa kila jeni

● Ukadiriaji wa usemi katika kiwango cha isoform

Vipimo vya huduma

Maktaba

Jukwaa

Mapato ya data yanayopendekezwa (Gb)

Udhibiti wa Ubora

cDNA-PCR(Poly-A iliyoboreshwa)

Nanopore PromethION P48

6 Gb/sampuli (Kulingana na aina)

Uwiano wa urefu kamili＞70%

Alama ya wastani ya ubora: Q10

Uchambuzi wa Bioinformatics

●Usindikaji wa data ghafi

● Utambulisho wa nakala

● Kuunganisha mbadala

● Ukadiriaji wa usemi katika kiwango cha jeni na kiwango cha isoform

● Uchambuzi wa usemi tofauti

● Ufafanuzi wa utendakazi na uboreshaji (DEGs na DETs)

Mahitaji ya Sampuli na Uwasilishaji

Mahitaji ya Sampuli:

Nucleotides:

Conc.(ng/μl)

Kiasi (μg)

Usafi

Uadilifu

≥ 100

≥ 0.6

OD260/280=1.7-2.5

OD260/230=0.5-2.5

Uchafuzi wa protini au DNA umepunguzwa au haujaonyeshwa kwenye jeli.

Kwa mimea: RIN≥7.0;

Kwa wanyama: RIN≥7.5;

5.0≥28S/18S≥1.0;

mwinuko mdogo au hakuna msingi

Kiini: Uzito(kavu): ≥1 g

*Kwa tishu ndogo kuliko miligramu 5, tunapendekeza kutuma sampuli ya tishu iliyogandishwa (katika nitrojeni kioevu).

Kusimamishwa kwa seli: Idadi ya seli = 3 × 10⁶- 1 × 10⁷

*Tunapendekeza kusafirisha lisate ya seli iliyoganda.Ikiwa seli itahesabu ndogo kuliko 5x10⁵, flash iliyogandishwa katika nitrojeni kioevu inapendekezwa, ambayo ni vyema kwa uchimbaji mdogo.

Sampuli za damu: Kiasi≥1 ml

Uwasilishaji wa Sampuli Uliopendekezwa

Chombo: 2 ml centrifuge tube (bati foil haifai)

Sampuli ya kuweka lebo: Kundi+ kunakili mfano A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...

Usafirishaji: 2, Barafu-kavu: Sampuli zinahitaji kuingizwa kwenye mifuko na kuzikwa kwenye barafu kavu.

Mirija ya RNAstable: Sampuli za RNA zinaweza kukaushwa kwenye mirija ya kusawazisha ya RNA (km RNAstable®) na kusafirishwa katika halijoto ya kawaida.

Mtiririko wa Kazi ya Huduma

Nucleotides:

Utoaji wa sampuli

Ujenzi wa maktaba

Kufuatana

Uchambuzi wa data

Huduma za baada ya kuuza

Mtiririko wa Kazi ya Huduma

Tishu:

Muundo wa majaribio

Utoaji wa sampuli

Uchimbaji wa RNA

Ujenzi wa maktaba

Kufuatana

Uchambuzi wa data

Huduma za baada ya kuuza

Iliyotangulia: Mpangilio wa urefu wa mRNA -PacBio

Inayofuata: 10x Genomics Visium Transcriptome

1.Uchanganuzi wa usemi tofauti -Njia ya Volcano

Uchanganuzi wa usemi tofauti unaweza kuchakatwa katika kiwango cha jeni ili kutambua jeni zinazoonyeshwa kwa njia tofauti (DEGs) na katika kiwango cha isoform ili kutambua tofauti.

3(1)

nakala zilizoonyeshwa (DETs)

2.Ramani ya joto ya nguzo ya viwango vya juu

3.Mbadala splicing kitambulisho na uainishaji

Aina tano za matukio mbadala ya kuunganisha yanaweza kutabiriwa na Astalavista.

4.Utambulisho wa matukio mbadala wa poly-adenylation (APA) na Motifu katika 50 bp juu ya mkondo wa poly-A

Kesi ya BMK

Kitambulisho mbadala cha kuunganisha na ukadiriaji wa kiwango cha isoform kwa mpangilio wa nukuu ya urefu kamili wa nanopore.

Iliyochapishwa:Mawasiliano ya Mazingira, 2020

Mkakati wa mpangilio:

Kuweka vikundi: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1(mutation K700E);3. B-seli za kawaida

Mkakati wa mpangilio: Mfuatano wa maktaba ya MinION 2D, mpangilio wa maktaba ya PromethION 1D;data iliyosomwa kwa muda mfupi kutoka kwa sampuli sawa

Jukwaa la mpangilio: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;

Matokeo muhimu

1.Kitambulisho cha Utengano Mbadala wa kiwango cha Isoform

Mifuatano iliyosomwa kwa muda mrefu huwezesha utambuzi wa SF3B1 inayobadilika^K700E-altered splice maeneo katika isoform-level.3'SS mbadala 35 na 5'SS mbadala 10 zilipatikana zikiwa zimegawanywa kwa njia tofauti kati ya SF3B1.^K700Ena SF3B1^WT.Mabadiliko 33 kati ya 35 yaligunduliwa hivi karibuni na mfuatano uliosomwa kwa muda mrefu.

2.Ukadiriaji wa Uwekaji Mbadala wa kiwango cha Isoform

Usemi wa isoform za uhifadhi wa intron(IR) katika SF3B1^K700Ena SF3B1^WTzilikadiriwa kulingana na mlolongo wa nanopore, ikionyesha udhibiti wa chini wa kimataifa wa isoform za IR katika SF3B1.^K700E.

Rejea

Tang AD , Soulette CM , Baren MJV , et al.Uainishaji wa manukuu ya urefu kamili wa mabadiliko ya SF3B1 katika leukemia sugu ya lymphocytic hufichua upunguzaji wa udhibiti wa introni zilizobaki[J].Mawasiliano ya asili.