METAGENOMI
Kompletta, slutna bakteriegenom från mikrobiomer med nanoporesekvensering
Nanopore-sekvensering |Metagenomics |MAGs |Cirkularisering av bakteriegenom |Tarmmikrobiota
Höjdpunkter
1. En ny metod för att extrahera långa fragment av DNA presenterades i denna studie, som uppnådde extraktion av mikrogram rent HMW-DNA lämpligt för långläst sekvensering från 300 mg avföring
2. Ett monteringsarbetsflöde, Lathe, introducerades i denna studie, där MAG:er sammansattes genom långa läsningar och korrigerades genom korta läsningar.
3. Svarv utvärderades genom skenblandning.7 av 12 bakterier monterades framgångsrikt till enstaka kontiger och 3 sammansattes till fyra eller färre kontiger.
4. Svarv applicerades ytterligare på avföringsprover, som genererade 20 cirkulära genom, inklusive Prevotella copri och kandidat Cibiobacter sp., som var kända för att vara rika på mobila genetiska element.
Huvudprestation
Extraktionsprotokoll för HWM DNA
Långlästa sekvenseringsbaserade tarmmetagenomiska studier har länge lidit av hårdhet vid extrahering av högmolekylärt (HMW) DNA från avföring.I denna studie introducerades ett enzymbaserat extraktionsprotokoll för att undvika omfattande skjuvning genom pärlslagning i traditionella metoder.Som visas i följande figur, behandlades proverna först med en cocktail av enzymer, inklusive lytiskt enzym, MetaPolyzyme, etc. för att bryta ner cellväggar.Frisatt DNA extraherades med fenol-kloroformsystem, följt av proteinas K- och RNase A-digestion, kolonnbaserad rening och SPRI-storleksval.Denna metod lyckades ge mikrogram HMW-DNA från 300 m avföring, som uppfyller långlästa sekvenseringskrav både vad gäller kvalitet och kvantitet.
Figur 1. HWM DNA-extraktionsschema
Schema flöde av svarv
Som beskrivs i följande figur, innehåller svarven befintlig process av rå basecalling-process med Guppy.Två långlästa enheter produceras sedan av Flye och Canu separat följt av felmontering upptäckt och borttagning.De två underenheterna slås samman med quickmerge.Vid sammanslagning kontrolleras sedan stora sammansättningar på megabasnivå för cirkularisering.Därefter behandlas konsensusförfining om dessa sammansättningar med korta läsningar.Slutligt sammansatta bakteriegenom bearbetas för slutlig detektering och avlägsnande av felmontering.
Figur 2. Schema flöde av svarv montering
Utvärdering av svarv med skenbakterieblandning
En standard ATCC 12-arter blandning innefattande både Gram-positiva och Gram-negativa bakterier användes för att utvärdera prestandan hos nanopore sekvenseringsplattform och svarv i MAG-montering.Totalt 30,3 Gb data genererades av nanopore-plattformen med N50 på 5,9 kb.Svarven förbättrade i hög grad montering N50 till 1,6 till 4-faldigt jämfört med andra långlästa monteringsverktyg och 2 till 9-faldigt jämfört med hybridmonteringsverktyg.Av 12 bakteriegenom, sattes sju samman till enstaka kontiger (Figur 3. Circos med svart prick).Tre till sattes ihop till fyra eller färre contigs, där den mest ofullständiga sammansättningen innehöll 83% av genomet i en enda contig.
Figur 3. Genomsammansättningar i en definierad 12-arter bakterieblandning
Applicering av svarv i avföringsprover
Denna metod applicerades ytterligare på mänskliga avföringsprover för att jämföra organismidentifieringen och sammansättningen med befintliga metoder, läs-moln- och kortläsningsbaserad analys.Från de tre inblandade proverna gav den nya enzymbaserade extraktionen minst 1 μg per 300 mg ingående massa.Nanopore-sekvensering av dessa HMW-DNA genererade långläsningar med N50 på 4,7 kb, 3,0 kb respektive 3,0 kb.Särskilt den nuvarande metoden visade stor potential i mikrobiell detektion jämfört med existerande metoder.Relativt högre alfadiversitet på artnivå visades här jämfört med kortläst och läsmoln.Dessutom återvanns alla släkten från kortläst analys, även typiskt lysresistenta grampositiva organismer, med denna metod.
Figur 4. Alfadiversitet och taxanomiska komponenter bestämt av Nanopore, kortläsnings- och läsmolnmetoder
Svarv gav mycket längre helhetssammansättning N50 än kortläsnings- och läsmolnmontering, trots tre till sex gånger lägre inmatning av rådata.Draft-genom producerades genom contig binning, där utkasten klassificerades i "hög kvalitet" eller "partiell" baserat på fullständighet, kontaminering, enkopia av kärngener, etc. Långläst sammansättning visade mycket högre anslutning till lägre kostnad jämfört med att kortläsa och läsa-moln.
Figur 5. Sammansättning per organism för varje metod
Dessutom är det nuvarande monteringssättet kapabelt att ge slutna, cirkulära genom.I avföringsproverna samlades åtta högkvalitativa enkelkontig genom och fem av dessa uppnådde percis cirkularisering.Långläst tillvägagångssätt visade också imponerande kapacitet för att lösa repetitiva element i genom.CirkuläriseradP. coprigenomet genererades genom detta tillvägagångssätt, som har varit känt för att innehålla hög grad av sekvensupprepning.Den bästa sammansättningen av detta genom genom kortläsning och läsmoln översteg aldrig N50 på 130 kb, även med täckningsdjup på 4800X.Dessa element med högt antal kopior löstes till fullo genom långläsningsmetod, som ofta hittas vid brytpunkter för kortläsnings- eller läsmolnsammansättningar.Ett annat stängt genom rapporterades i denna studie, som antogs vara en medlem av nyligen beskrivnaCibiobakterclade.Fem förmodade fager identifierades i denna slutna sammansättning, från 8,5 till 65,9 kb.
Figur 6. Cirkosdiagram över slutna genom av P.copri och Cibiobacter sp.
Referens
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Kompletta, slutna bakteriegenom från mikrobiomer med nanoporesekvensering.Naturens bioteknik,38(6), 701-707.
Teknik och höjdpunkter syftar till att dela den senaste framgångsrika tillämpningen av olika högkapacitetssekvenseringsteknologier på olika forskningsarenor samt briljanta idéer inom experimentell design och datautvinning.
Posttid: 2022-07-07