HELA GENOMSEKVENSNING
Genomisk övervakning av SARS-CoV-2 avslöjar en Nsp1-deletionsvariant som modulerar typ I-interferonsvar
Nanopore |Illumina |Resekvensering av hela genomet |metagenomics |RNA-Seq |Sanger
Biomarker Technologies gav tekniskt stöd för provsekvensering i denna studie.
Höjdpunkter
1. SARS-CoV-2 genomsekvensering och fylogenetisk analys identifierar 35 återkommande mutationer inklusive 31 SNP:er och 4 Indels.
2.Association med 117 kliniska fenotyper avslöjar potentiellt
viktiga mutationer.
∆500-532 i Nsp1-kodande region korrelerar med lägre virus
3.laddning och serum IFN-β.
4. Virala isolat med ∆500-532 mutation inducerar lägre IFN-I
svar i de infekterade cellerna.
Experimentell design
Prestationer
1. Covid-19 epidemiologisk och genomisk övervakning
Klinisk data samlades in i Sichuan-provinsen, Kina under utbrottsperioden från 22 januari 2020 till 20 februari 2020. Totalt 538 fall av covid-19 bekräftades av qPCR-tester i Sichuan, varav 28,8 % var från provinsen huvudstad.Bekräftade fall i Sichuan ökade exponentiellt och nådde sin topp den 30 januari.Data stödde också att social distansering kan vara en nyckelfaktor för att förhindra virusspridning.
Figur 1. Epidemiologisk studie av covid-19 i Sichuan-provinsen, Kina
2. SARS-CoV-2-genomkonstruktion och variantidentifiering
Med multiplex PCR-amplifiering följt av nanopore-sekvensering genererades totalt 310 nästan eller partiellt kompletta genom från 248 patienter med ca.80 % av genomen täcks av 10 läsningar (medeldjup: 0,39 M läsningar per prov).
Figur 2. Frekvens av varje variant i Sichuan-kohorten
Totalt 104 SNP och 18 Indels identifierades från SARS-CoV-2-genom, där 31 SNP och 4 Indels identifierades som återkommande genetiska varianter.Genom att jämföra dem med 169 prover från Wuhan och med 81 391 högkvalitativa offentliga genomsekvenser i GISAID, presenterades 29 av de 35 varianterna på andra kontinenter.Noterbart befanns fyra varianter inklusive ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 och T13243C endast förekomma i Sichuan och Wuhan och saknas i GISAID-data, vilket tyder på att dessa varianter med stor sannolikhet kommer att importeras från Wuhan, som uppfyller resejournaler för patienter.
Evolutionsanalys med maximal sannolikhet (ML) metod och Bayesianska molekylära klockmetoder bearbetades på 88 nya virus från Sichuan och 250 kurerade genom från andra regioner.Genom med ∆500-532 (deletioner i Nsp1-kodande region) hittades glest fördelade i det fylogenetiska trädet.Haplotypanalys på Nsp1-varianter identifierade 5 av dem från flera städer.Dessa resultat antydde att ∆500-532 förekom i flera städer och kan importeras flera gånger från Wuhan.
Figur 2. Återkommande genetiska varianter och fylogenetisk analys i SARS-CoV-2-genomen
3. Samband av återkommande genetiska varianter med kliniska implikationer
117 kliniska fenotyper var associerade med svårighetsgraden av covid-19, där 19 svårighetsgradsrelaterade fenotyper klassificerades i svåra och icke-svåra egenskaper.Förhållandet mellan dessa egenskaper och 35 återkommande genetiska varianter viualiserades i bi-kluster värmekarta.En GSEA-liknande rankad anrikningsanalys visade att ∆500-532 är negativt korrelerad med ESR, serum IFN-β och CD3+CD8+ T-cellantal i blodet.Dessutom visade qPCR-tester att patienter infekterade med virus som hyser ∆500-532 hade det högsta Ct-värdet, dvs lägst virusmängd.
Figur 3. Associationer av 35 återkommande genetiska varianter med kliniska fenotyper
4. Validering av viral mutationsassocierade kliniska fenotyper
För att förstå effekterna av ∆500-532 på Nsp1-funktioner transfekterades HEK239T-celler med plasmider som uttrycker fullängds-, WT Nsp1- och mutantformer med deletioner.Transkriptomprofiler för varje behandlad HEK239T-cell bearbetades för PCA-analys, vilket visar att deletionsmutanter klustrades relativt närmare och skilde sig signifikant från WT Nsp1.Generna som var signifikant uppreglerade i mutanterna anrikades huvudsakligen i "peptidbiosyntetisk/metabolisk process", "biogenes av ribonukleoproteinkomplex", "proteininriktning mot membran/ER", etc. Dessutom visade två deletioner ett distinkt expssionsmönster från WT.
Figur 4. Transkriptomanalys på HEK239T-celler transfekterade av WT Nsp1 och det med deletioner
Effekterna av deletioner på IFN-1-svar testades också i överuttryckt studie.Alla testade deletioner visades minska IFN-1-repsons i transfekterade HEK239T- och A549-celler på både transkriptomnivå och proteinnivå.Intressant nog var de signifikant nedreglerade generna i deletioner berikade i "försvarssvar på virus", "viral genomreplikation", "reglering av transkription av RNA-polymeras II" och "svar på typ I-interferon".
Figur 5. Nedreglering av interferonsignaleringsvägar i ∆500-532 mutant
I denna studie bekräftades effekten av dessa deletioner på virus ytterligare av virusinfektionsstudier.Virus med vissa mutanter isolerades från kliniska prover och infekterades till Calu-3-celler.Detaljerade resultat om virusinfektionsstudier kan läsas i tidningen.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Referens
Lin J, Tang C, Wei H, et al.Genomisk övervakning av SARS-CoV-2 avslöjar en Nsp1-deletionsvariant som modulerar typ I-interferonsvar [J].Cellvärd och mikrober, 2021.
Nyheter och höjdpunkter syftar till att dela de senaste framgångsrika fallen med Biomarker Technologies, fånga nya vetenskapliga landvinningar såväl som framstående tekniker som tillämpas under studien.
Posttid: Jan-06-2022