Fullängds mRNA-sekvensering -PacBio

De novofullängds transkriptomsekvensering, även känd somDe novoIso-Seq utnyttjar fördelarna med PacBio-sequencer i läslängd, vilket möjliggör sekvensering av fullängds cDNA-molekyler utan några avbrott.Detta undviker helt alla fel som genereras i transkriptmonteringsstegen och konstruerar unigenuppsättningar med upplösning på isoformnivå.Dessa unigenuppsättningar ger kraftfull genetisk information som "referensgenom" på transkriptomnivå.Dessutom, i kombination med nästa generations sekvenseringsdata, möjliggör denna tjänst en korrekt kvantifiering av uttryck på isoformnivå.

Plattform: PacBio Sequel II

Bibliotek: SMRT bell library

Kontakta oss

Servicedetaljer

Demoresultat

Fallstudie

Servicefördelar

● Direkt avläsning av cDNA-molekyl i full längd från 3'-änden till 5'-änden

● Iso-form nivåupplösning i sekvensstruktur

● Avskrifter med hög noggrannhet och integritet

● Mycket kompatibel med vaiours arter

● Stor sekvenseringskapacitet med 4 PacBio Sequel II sekvenseringsplattformar utrustade

● Mycket erfaren med över 700 Pacbio-baserade RNA-sekvenseringsprojekt

● BMKCloud-baserad resultatleverans: Anpassad datautvinning tillgänglig på plattformen.

● Eftermarknadstjänster giltiga i 3 månader efter projektets slutförande

Servicespecifikationer

Plattform: PacBio Sequel II

Sekvenseringsbibliotek: Poly A-berikat mRNA-bibliotek

Rekommenderat datautbyte: 20 Gb/prov (beroende på art)

FLNC（%）： ≥75%

*FLNC: Icke-chimära transcipter i full längd

Bioinformatikanalyser

● Bearbetning av rådata

● Avskriftsidentifiering

● Sekvensstruktur

● Kvantifiering av uttryck

● Funktionsanteckning

Exempel på krav och leverans

Exempelkrav:

Nukleotider:

Konc.(ng/μl)

Mängd (μg)

Renhet

Integritet

≥ 120

≥ 0,6

OD260/280=1,7-2,5

OD260/230=0,5-2,5

Begränsad eller ingen protein- eller DNA-kontamination visas på gelen.

För växter: RIN≥7,5;

För djur: RIN≥8,0;

5,0≥ 28S/18S≥1,0;

begränsad eller ingen baslinjehöjning

Vävnad: Vikt (torr):≥1 g
*För vävnad som är mindre än 5 mg rekommenderar vi att du skickar snabbfryst (i flytande kväve) vävnadsprov.

Cellsuspension:Cellantal = 3×10⁶- 1×10⁷
*Vi rekommenderar att du skickar fruset cellysat.Om cellen räknas mindre än 5×10⁵, snabbfryst i flytande kväve rekommenderas, vilket är att föredra för mikroextraktion.

Blodprover:Volym ≥1 ml

Mikroorganism:Massa ≥ 1 g

Rekommenderad provleverans

Behållare:
2 ml centrifugrör (stålfolie rekommenderas inte)
Provmärkning: Grupp+replikat t.ex. A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...

Sändning:

1. Torris: Proverna måste packas i påsar och grävas ner i torris.
2. RNAstabila rör: RNA-prover kan torkas i RNA-stabiliseringsrör (t.ex. RNAstable®) och skickas i rumstemperatur.

Service Arbetsflöde

Experimentdesign

Provleverans

RNA-extraktion

Byggande av bibliotek

Sekvensering

Dataanalys

Service efter försäljning

Tidigare: Eukaryot mRNA Sequencing-Illumina

Nästa: Fullängds mRNA-sekvensering-Nanopore

1.FLNC längdfördelning

Längden på fullängds icke-chimär läsning (FLNC) indikerar längden av cDNA i bibliotekskonstruktion.FLNC-längdfördelning är en avgörande indikator för att utvärdera kvaliteten på biblioteksbyggandet.

mRNA-FLNC-läs-längd-fördelning

FLNC läslängdsfördelning

2. Komplett ORF-regionens längdfördelning

Vi använder TransDecoder för att förutsäga proteinkodande regioner och motsvarande aminosyrasekvenser för att generera unigenuppsättningar, som innehåller fullständig icke-redundant transkriptionsinformation i alla prover.

mRNA-Fullständig-ORF-längdfördelning

Komplett ORF-regionens längdfördelning

3. KEGG väganrikningsanalys

Differentiellt uttryckta transkript (DETs) kan identifieras genom att anpassa NGS-baserade RNA-sekvenseringsdata på fullängdstranskriptuppsättningar genererade av PacBio-sekvenseringsdata.Dessa DETs kan vidarebearbetas för olika funktionella analyser, t.ex. KEGG-väganrikningsanalys.

mRNA-DEG-KEGG-väg-anrikning

DET KEGG väganrikning -Prickplot

BMK Fall

Utvecklingsdynamiken hos Populus stamtranskriptom

Publicerad: Plant Biotechnology Journal, 2019

Sekvenseringsstrategi:
Provsamling:stamregioner: apex, första internod(IN1), andra internod(IN2), tredje internod(IN3), internod(IN4) och internod(IN5) från Nanlin895
NGS-sekvens:RNA från 15 individer slogs samman som ett biologiskt prov.Tre biologiska replikat av varje punkt bearbetades för NGS-sekvens
TGS-sekvens:Stamregioner delades in i tre regioner, dvs apex, IN1-IN3 och IN4-IN5.Varje region bearbetades för PacBio-sekvensering med fyra typer av bibliotek: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb och 3-10 kb.

Nyckelresultat

1.Totalt 87150 fullängdstranskript identifierades, i vilka 2081 nya isoformer och 62058 nya alternativa splitsade isoformer identifierades.
2,1187 lncRNA och 356 fusionsgener identifierades.
3. Från primär tillväxt till sekundär tillväxt identifierades 15838 differentiellt uttryckta transkript från 995 differentiellt uttryckta gener.I alla DEG var 1216 transkriptionsfaktorer, varav de flesta ännu inte har rapporterats.
4.GO-anrikningsanalys avslöjade betydelsen av celldelning och oxidationsreduktionsprocess i primär och sekundär tillväxt.