METAGENOMI
Génom baktéri lengkep sareng ditutup tina mikrobiom nganggo urutan nanopore
Urutan Nanopore |Métagénomik |MAGS |Sirkularisasi génom baktéri |Mikrobiota peujit
Sorotan
1.A métode novel pikeun nimba fragmen panjang DNA dibere dina ulikan ieu, nu achived ékstraksi microgram murni, HMW DNA cocog pikeun lila-baca sequencing ti 300 mg stool.
2.Hiji workflow assembly, Lathe, diwanohkeun dina ulikan ieu, dimana MAGs anu dirakit ku dibaca panjang tur dilereskeun ku pondok-maca.
3. Lathe dievaluasi ku campuran mock.7 ti 12 baktéri anu hasil dirakit kana contigs tunggal jeung 3 anu dirakit kana opat atawa kurang contigs.
4.Lathe ieu salajengna dilarapkeun ka sampel stool, nu dihasilkeun 20 génom circularized, kaasup Prevotella copri jeung calon Cibiobacter sp., anu dipikanyaho beunghar ku unsur genetik sélulér.
Prestasi Utama
Protokol ékstraksi pikeun DNA HWM
Panaliti metagénomik usus dumasar kana urutan anu panjang parantos lami ngalaman karasa dina ékstrak DNA beurat molekular (HMW) tina bangku.Dina ulikan ieu, hiji protokol ékstraksi dumasar-énzim diwanohkeun pikeun nyegah shearing éksténsif ku bead ngéléhkeun dina métode tradisional.Ditémbongkeun saperti dina gambar di handap ieu, sampel mimiti dirawat ku cocktail énzim, kaasup énzim litik, MetaPolyzyme, jsb pikeun nguraikeun tembok sél.DNA anu dileupaskeun diekstrak ku sistem Phenol-chloroform, dituturkeun ku Proteinase K sareng RNase A nyerna, purifikasi dumasar kolom sareng pilihan ukuran SPRI.Metoda ieu junun ngahasilkeun micrograms DNA HMW tina 300 m stool, nu minuhan sarat sequencing lila-baca dina watesan kualitas jeung kuantitas.
Gambar 1. skéma ékstraksi DNA HWM
Aliran skéma tina Lathe
Sakumaha anu dijelaskeun dina gambar di handap ieu, Lathe ngandung prosés prosés dasar atah nganggo Guppy.Dua majelis lila-dibaca lajeng dihasilkeun ku Flye na Canu misah dituturkeun ku deteksi mis-assembly sarta ngaleupaskeun.Dua sub-assemblies dihijikeun sareng quickmerge.Saatos ngahiji, rakitan ageung di tingkat megabase teras dipariksa pikeun sirkularisasi.Salajengna, perbaikan konsensus ngeunaan majelis ieu diolah kalayan bacaan pondok.Génom baktéri anu dirakit ahir diprosés pikeun deteksi sareng ngaleungitkeun panyabutan terakhir.
Gambar 2. Skéma aliran assembly Lathe
Evaluasi Lathe kalayan campuran baktéri bohongan
Campuran standar ATCC 12-spésiés anu diwangun ku baktéri Gram-positip sareng Gram-négatip dianggo pikeun ngévaluasi kinerja platform urutan nanopore sareng Lathe dina rakitan MAG.Jumlahna aya 30,3 data Gb dihasilkeun ku platform nanopore kalayan N50 tina 5,9 kb.Lathe sakitu legana ningkat assembly N50 mun 1,6 mun 4-melu dibandingkeun parabot assembly lila-baca sejen tur 2 mun 9-melu dibandingkeun parabot assembly hybridd.Tina 12 génom baktéri, tujuh dirakit kana contigs tunggal (Gambar 3. Circos kalawan titik hideung).Tilu deui anu dirakit kana opat atawa kurang contigs, nu assembly paling teu lengkep ngandung 83% tina génom dina contig tunggal.
Gambar 3. Rakitan génom dina campuran baktéri 12-spésiés anu diartikeun
Aplikasi Lathe dina sampel stool
Metoda ieu salajengna dilarapkeun ka sampel tai manusa guna ngabandingkeun idéntifikasi organisme jeung contiguity assembly kana métode aya, maca-awan jeung analisis dumasar pondok-baca.Tina tilu sampel aub, ékstraksi dumasar-énzim anyar yielded sahenteuna 1 μg per 300 mg massa input.Urutan nanopore tina DNA HMW ieu ngahasilkeun bacaan panjang kalayan N50 masing-masing 4.7 kb, 3.0kb sareng 3.0kb.Utamana, metode ayeuna nunjukkeun poténsi anu ageung dina deteksi mikroba dibandingkeun sareng metode anu aya.Karagaman alfa tingkat spésiés anu rélatif luhur dipidangkeun di dieu dibandingkeun sareng maca pondok sareng awan baca.Leuwih ti éta, sakabéh genera tina analisis pondok-baca, sanajan ilaharna lysis-tahan organisme Gram-positip, pulih ku metoda ieu.
Gambar 4. Keragaman alfa sareng komponén taksonomi ditangtukeun ku metode Nanopore, maca pondok sareng maca awan
Lathe ngahasilkeun langkung panjang sadayana-assembly N50 ti pondok-baca jeung maca-awan assembly, sanajan tilu nepi ka genep kali leuwih handap input data atah.Draf génom dihasilkeun ku contig binning, nu draf digolongkeun kana "kualitas luhur" atawa "parsial" dumasar kana completeness, kontaminasi, single-copy gén core, jsb Majelis lila-dibaca ditémbongkeun contiguity loba nu leuwih luhur di ongkos handap dibandingkeun ka pondok-baca jeung baca-awan.
Gambar 5. Per-organisme assembly contiguity unggal métode
Leuwih ti éta, pendekatan assembly ayeuna sanggup ngahasilkeun ditutup, génom sirkular.Dina sampel stool, dalapan kualitas luhur, génom single-contig anu dirakit jeung lima ieu kahontal circularization percise.pendekatan lila-baca ogé némbongkeun kapasitas impressive dina resolving elemen repetitive dina génom.DiedarkeunP. coprigénom dihasilkeun ku pendekatan ieu, nu geus dipikawanoh ngandung tingkat luhur pengulangan runtuyan.Majelis pangsaéna tina génom ieu ku pondok-baca sareng awan-baca henteu pernah ngaleuwihan N50 tina 130 kb, bahkan kalayan jerona sinyalna 4800X.Unsur angka salinan tinggi ieu direngsekeun pinuh ku pendekatan lila-baca, nu mindeng kapanggih dina titik putus tina rakitan pondok-baca atawa baca-awan.Génom katutup anu sanés dilaporkeun dina ulikan ieu, anu dipercaya janten anggota anu nembe dijelaskeunCibiobacterclade.Lima phage putative dicirikeun dina assembly katutup ieu, mimitian ti 8,5 nepi ka 65,9 kb.
Gambar 6. Diagram sirkos génom katutup P.copri jeung Cibiobacter sp.
Rujukan
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Génom baktéri lengkep sareng ditutup tina mikrobiom nganggo urutan nanopore.Biotéhnologi alam,38(6), 701-707.
Tech jeung Highlights Tujuanana pikeun ngabagikeun aplikasi suksés panganyarna tina téknologi sequencing throughput tinggi anu béda dina sagala rupa arena panalungtikan ogé ideu cemerlang dina desain ékspérimén sareng pertambangan data.
waktos pos: Jan-07-2022