TRANSKRIPTOMI
alam
KOMUNIKASI
Karakterisasi transkrip panjangna mutasi SF3B1 dina leukemia limfositik kronis ngungkabkeun turunna régulasi intron anu ditahan.
Transkrip panjang lengkep|Urutan nanopore|Analisis isoform alternatif
Latar
Smutasi omatic dina faktor splicing SF3B1 geus loba dilaporkeun pakait sareng rupa kangker, kaasup leukemia limfositik kronis (CLL), melanoma uveal, kanker payudara, jsb Sajaba ti éta, studi transcriptomic pondok-baca geus ngungkabkeun pola splicing aberrant ngainduksi ku mutasi SF3B1.Nanging, studi ngeunaan pola splicing alternatif ieu parantos lami dugi ka tingkat-kajadian sareng kurangna pangaweruh ngeunaan tingkat isoform kusabab keterbatasan transkrip anu dirakit anu dibaca pondok.Di dieu, platform sequencing nanopore diwanohkeun pikeun ngahasilkeun transkrip panjang pinuh, anu nguatkeun inverstigation dina isoform AS.
Desain ékspériméntal
Percobaan
Pangkelompok:1. CLL-SF3B1 (WT) 2. CLL-SF3B1 (mutasi K700E);3. Sél B normal
Strategi urutan:Sequencing perpustakaan Minion 2D, urutan perpustakaan PromethION 1D;data pondok-baca tina sampel sarua
Platform urutan:ONT Minion;ONT PromethION;
Analisis Bioinformatika
Hasilna
Atotal 257 juta dibaca dihasilkeun tina 6 sampel CLL jeung 3 B-sél.Rata-rata 30.5% tina bacaan ieu diidentifikasi minangka transkrip panjangna.
FAnalisis isoform alternatif panjang-panjang tina RNA (FLAIR) dikembangkeun pikeun ngahasilkeun sakumpulan isoform anu kapercayaan luhur.FLAIR tiasa diringkeskeun salaku:
Nanopore maca alignment: ngaidentipikasi struktur transkrip umum dumasar kana génom rujukan;
SKoréksi simpang plice: kasalahan runtuyan bener(beureum) jeung situs splice boh intron annotated, intron tina data pondok-baca atawa duanana;
Collapse: nyimpulkeun isoforms wawakil dumasar kana ranté simpang splice (first-pass set).Pilih kapercayaan anu luhur tina dumasar kana jumlah bacaan anu ngadukung (Ambang: 3).
Gambar 1. Analisis FLAIR pikeun ngaidentipikasi isoform full-lenth pakait sareng mutasi SF3B1 dina CLL
FLAIR Identipikasi 326,699 isoforms spliced kapercayaan tinggi, 90% diantarana isoforms novel.Kalolobaan isoforms unannotated ieu kapanggih janten kombinasi novel tina sambungan splice dipikawanoh (142,971), sedengkeun isoforms novél sésana ngandung boh intron ditahan (21,700) atawa novél exon (3594).
Lruntuyan ong-baca empowers idéntifikasi tina mutant SF3B1-K700E -dirobah situs splice di isoform-tingkat.35 alternatif 3'SSs jeung 10 alternatif 5'SSs kapanggih sacara signifikan diferensial spliced antara SF3B1-K700E na SF3B1-WT.33 tina 35 alterations anyar kapanggih ku urutan lila dibaca.Dina data Nanopore, sebaran jarak antara SF3B1-K700E-ngarobah 3'SSs ka puncak situs canonical nyaeta sabudeureun -20 bp, nu béda nyata ti sebaran kontrol, sarupa jeung naon geus dilaporkeun dina CLL pondok-baca runtuyan.Isoforms gén ERGIC3 dianalisis, dimana isoform novel ngandung situs splice proksimal kapanggih leuwih loba pisan di SF3B1-K700E.Duanana proksimal sareng distal 3'SS dikaitkeun sareng pola AS anu béda anu ngahasilkeun sababaraha isoform.
Gambar 2. Pola splicing alternatif 3′ dicirikeun ku data sequencing nanopore
Analisis pamakean acara IR parantos lami diwatesan dina analisis dumasar-baca pondok kusabab kapercayaan kana idéntifikasi sareng kuantifikasi IR.Ekspresi isoform IR dina SF3B1-K700E sareng SF3B1-WT diitung dumasar kana urutan nanopore, ngungkabkeun régulasi global tina isoform IR dina SF3B1-K700E.
Gambar 4. Inténsitas tatanén sareng konektipitas jaringan dina tilu sistem pertanian (A sareng B);Analisis leuweung acak(C) jeung Hubungan antara inténsitas tatanén jeung kolonisasi AMF (D)
Gambar 3. Kajadian rentenir intron leuwih kuat diturunkeun dina CLL SF3B1-K700E
Téknologi
Nanopore Long-baca Sequencing
Nsequencing anopore mangrupakeun molekul tunggal real-time téhnologi sequencing sinyal listrik.
DDNA atanapi RNA anu terdampar ouble bakal ngabeungkeut protéin nanoporous anu aya dina biofilm sareng ngantunkeun dina kalungguhan protéin motor.
DUntaian NA/RNA ngaliwatan protéin saluran nanopore dina laju nu tangtu dina pangaruh béda tegangan.
Molecules ngahasilkeun sinyal listrik béda nurutkeun struktur kimiawi.
Rdeteksi eal-waktos runtuyan kahontal ku nelepon basa.
Kinerja sekuen transkriptom panjang pinuh
√ Data Saturasi
7-melu pangsaeutikna bacaan diperlukeun pikeun ngahontal jenuh data comparable.
√ Idéntifikasi Struktur Transkrip
Idéntifikasi variasi struktural anu rupa-rupa kalayan konsensus maca panjangna unggal transkrip
√ Transkrip-tingkat analisis diferensial -Reveal parobahan disumputkeun ku pondok-maca
Rujukan
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Karakterisasi transkrip panjang pinuh ku mutasi SF3B1 dina leukemia limfositik kronis ngungkabkeun turunna régulasi intron anu dipikagaduh [J].Komunikasi Alam.
Tech jeung Highlights Tujuanana pikeun ngabagikeun aplikasi suksés panganyarna tina téknologi sequencing throughput tinggi anu béda dina sagala rupa arena panalungtikan ogé ideu cemerlang dina desain ékspérimén sareng pertambangan data.
waktos pos: Jan-08-2022