МЕТАГЕНОМИКА
Комплетни, затворени бактеријски геноми из микробиома помоћу секвенцирања нанопора
Нанопоре Секуенцинг |Метагеномицс |МАГс |Циркуларизација бактеријског генома |Микробиота црева
Хигхлигхтс
1. У овој студији је представљена нова метода за екстракцију дугих фрагмената ДНК, која је постигла екстракцију микрограма чисте, ХМВ ДНК погодне за дуго читано секвенцирање из 300 мг столице
2. У овој студији уведен је ток рада монтаже, Струг, где су МАГ-ови састављени дугим читањем и исправљени кратким читањима.
3. Струг је процењен лажном мешавином.7 од 12 бактерија је успешно састављено у појединачне контиге, а 3 су састављене у четири или мање контига.
4. Латхе је даље примењен на узорке столице, који су генерисали 20 циркуларизованих генома, укључујући Превотелла цопри и кандидата Цибиобацтер сп., који су били познати по томе што су богати мобилним генетским елементима.
Главно достигнуће
Протокол екстракције за ХВМ ДНК
Дуго читане метагеномске студије црева засноване на секвенцирању дуго су патиле од тврдоће при екстракцији ДНК високе молекуларне тежине (ХМВ) из столице.У овој студији, уведен је протокол екстракције заснован на ензимима да би се избегло екстензивно смицање уз помоћ перли у традиционалним методама.Као што је приказано на следећој слици, узорци су прво третирани коктелом ензима, укључујући литички ензим, МетаПолизиме, итд. да би се разградили ћелијски зидови.Ослобођена ДНК је екстрахована фенол-хлороформ системом, праћена дигестијом протеиназе К и РНазе А, пречишћавањем на бази колоне и одабиром величине СПРИ.Ова метода је успела да добије микрограме ХМВ ДНК са 300 м столице, што испуњава захтеве секвенционирања дугог читања у погледу квалитета и квантитета.
Слика 1. Шема екстракције ХВМ ДНК
Шема тока струга
Као што је описано на следећој слици, Латхе садржи постојећи процес сировог процеса основног позивања користећи Гуппи.Два дуго читана склопа затим производе Флие и Цану одвојено, након чега следи откривање погрешног склапања и уклањање.Два подсклопа су спојена брзим спајањем.Након спајања, велики склопови на нивоу мегабазе се затим проверавају за циркуларизацију.Након тога, прецизирање консензуса на овим склоповима се обрађује кратким читањем.Коначно састављени бактеријски геноми се обрађују за коначно откривање и уклањање погрешног састављања.
Слика 2. Шема тока склопа струга
Процена струга са лажном мешавином бактерија
Стандардна мешавина АТЦЦ 12 врста која садржи и Грам-позитивне и Грам-негативне бактерије је коришћена за процену перформанси платформе за секвенцирање нанопора и Струг у МАГ склопу.Укупно 30,3 Гб података генерисано је нанопоре платформом са Н50 од 5,9 кб.Струг је у великој мери побољшао монтажу Н50 на 1,6 до 4 пута у поређењу са другим алатима за дуго читање и 2 до 9 пута у поређењу са хибридним алатима за монтажу.Од 12 бактеријских генома, седам је састављено у појединачне контиге (Слика 3. Цирцос са црном тачком).Још три су састављене у четири или мање контига, у којима је најнепотпунији склоп садржао 83% генома у једном контигу.
Слика 3. Склопови генома у дефинисаној мешавини бактерија од 12 врста
Примена струга у узорцима столице
Ова метода је даље примењена на узорке људске столице да би се упоредила идентификација организма и контигност склопа са постојећим методама, анализама заснованим на читању у облаку и кратком читању.Од три укључена узорка, нова екстракција заснована на ензиму дала је најмање 1 μг на 300 мг улазне масе.Секвенцирање нанопора ове ХМВ ДНК је генерисало дуго читање са Н50 од 4,7 кб, 3,0 кб и 3,0 кб респективно.Значајно је да је садашња метода показала велики потенцијал у детекцији микроба у поређењу са постојећим методама.Овде је приказана релативно већа алфа разноврсност на нивоу врсте у поређењу са кратким читањем и читањем у облаку.Штавише, сви родови из анализе кратког читања, чак и типично грам-позитивни организми отпорни на лизу, пронађени су овом методом.
Слика 4. Алфа разноврсност и таксаномске компоненте одређене Нанопоре, методама кратког читања и читања у облаку
Струг је дао много дужи цели склоп Н50 од склопа за кратко читање и читање у облаку, упркос три до шест пута мањем уносу необрађених података.Нацрти генома су произведени спајањем контига, у којем су нацрти класификовани у „висококвалитетне“ или „делимичне“ на основу комплетности, контаминације, гена језгра једне копије, итд. Дуго читани склоп показао је много већу повезаност по нижој цени у поређењу са на кратко читање и читање у облаку.
Слика 5. Непрекидност склопа по организму сваке методе
Штавише, садашњи приступ састављању је способан да произведе затворене, кружне геноме.У узорцима столице састављено је осам висококвалитетних једноконтиг генома, а пет од њих је постигло перцизну циркуларизацију.Приступ који се дуго читао такође је показао импресиван капацитет у решавању репетитивних елемената у геномима.ЦиркуларизованоП. цопригеном је генерисан овим приступом, за који је познато да садржи висок степен понављања секвенце.Најбољи склоп овог генома помоћу кратког читања и читања-облака никада није премашио Н50 од 130 кб, чак и са дубином покривености од 4800Кс.Ови елементи великог броја копија су у потпуности решени приступом дугог читања, који се често налази на преломним тачкама склопова за кратко читање или читање у облаку.У овој студији је пријављен још један затворени геном, за који се веровало да је члан недавно описаногЦибиобацтерцладе.Пет наводних фага је идентификовано у овом затвореном склопу, у распону од 8,5 до 65,9 кб.
Слика 6. Цирцос дијаграм затворених генома П.цопри и Цибиобацтер сп.
Референце
Мосс, ЕЛ, Магхини, ДГ, & Бхатт, АС (2020).Комплетни, затворени бактеријски геноми из микробиома помоћу секвенцирања нанопора.Природна биотехнологија,38(6), 701-707.
Тецх анд Хигхлигхтс има за циљ да подели најновију успешну примену различитих технологија секвенцирања високе пропусности у различитим истраживачким аренама, као и бриљантне идеје у експерименталном дизајну и рударењу података.
Време поста: Јан-07-2022