Секвенцирање мРНА пуне дужине-Нанопоре
Предности услуге
● Пристрасност ниске секвенце
● Откривање цДНК молекула пуне дужине
● Потребно је мање података за покривање истог броја транскрипата
● Идентификација више изоформа по гену
● Квантификација експресије на нивоу изоформе
Спецификације услуге
| Библиотека | Платформа | Препоручени обим података (Гб) | Контрола квалитета |
| цДНА-ПЦР (обогаћен поли-А) | Нанопоре ПрометхИОН П48 | 6 Гб/узорак (у зависности од врсте) | Однос пуне дужине＞70% Просечна оцена квалитета: К10
|
Биоинформатичке анализе
●Обрада сирових података
● Идентификација транскрипта
● Алтернативно спајање
● Квантификација експресије на нивоу гена и нивоу изоформе
● Анализа диференцијалног израза
● Напомене и обогаћивање функција (ДЕГ и ДЕТ)
Захтеви за узорке и достава
Захтеви за пример:
нуклеотиди:
| Конц. (нг/μл) | Количина (μг) | Чистоћа | Интегритет |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | ОД260/280=1,7-2,5 ОД260/230=0,5-2,5 Ограничена или никаква контаминација протеина или ДНК приказана на гелу. | За биљке: РИН≥7,0; За животиње: РИН≥7,5; 5.0≥28С/18С≥1.0; ограничена или никаква почетна висина |
Ткиво: Тежина (суво): ≥1 г
*За ткиво мање од 5 мг, препоручујемо да пошаљете флеш замрзнут (у течном азоту) узорак ткива.
Суспензија ћелија: Број ћелија = 3×106- 1×107
*Препоручујемо да пошаљете замрзнути ћелијски лизат.У случају да та ћелија броји мањи од 5×105, препоручује се брзо замрзавање у течном азоту, што је пожељно за микро екстракцију.
Узорци крви: Запремина≥1 мл
Препоручена достава узорка
Контејнер: епрувета за центрифугирање од 2 мл (не препоручује се лимена фолија)
Означавање узорка: Група+репликација нпр. А1, А2, А3;Б1, Б2, Б3 ... ...
Испорука: 2、Суви лед: Узорци се морају спаковати у вреће и закопати у суви лед.
- РНК стабилне епрувете: Узорци РНК се могу осушити у епрувети за стабилизацију РНК (нпр. РНАстабле®) и послати на собној температури.
Ток рада услуге
нуклеотиди:
Испорука узорка
Изградња библиотеке
Секуенцинг
Анализа података
Услуге након продаје
Ток рада услуге
ткиво:
Дизајн експеримента
Испорука узорка
Екстракција РНК
Изградња библиотеке
Секуенцинг
Анализа података
Услуге након продаје
1.Анализа диференцијалног израза -Вулкански дијаграм
Анализа диференцијалне експресије може се обрадити и на нивоу гена да би се идентификовали различито експримирани гени (ДЕГ) и на нивоу изоформе да би се идентификовали различито
изражени транскрипти (ДЕТ)
2.Топлотна мапа хијерархијског кластера
3.Алтернативна идентификација и класификација спајања
Асталависта може предвидети пет типова алтернативних догађаја спајања.
4.Идентификација и мотив алтернативних догађаја полиаденилације (АПА) на 50 бп узводно од поли-А
БМК Цасе
Алтернативна идентификација спајања и квантификација на нивоу изоформе секвенцирањем транскриптома пуне дужине нанопора
Објављено:Природне комуникације, 2020
Стратегија секвенцирања:
Груписање: 1. ЦЛЛ-СФ3Б1(ВТ);2. ЦЛЛ-СФ3Б1 (мутација К700Е);3. Нормалне Б-ћелије
Стратегија секвенцирања: МинИОН 2Д секвенцирање библиотеке, ПрометхИОН 1Д секвенцирање библиотеке;кратко прочитани подаци из истих узорака
Платформа за секвенцирање: Нанопоре МинИОН;Нанопоре ПрометхИОН;
Кључни резултати
1. Идентификација алтернативног спајања на нивоу изоформе
Дуго читане секвенце омогућавају идентификацију мутанта СФ3Б1К700Е-измењена места спајања на нивоу изоформе.Утврђено је да су 35 алтернативних 3′СС и 10 алтернативних 5′СС значајно различито спојени између СФ3Б1К700Еи СФ3Б1WT.33 од 35 измена су недавно откривене дуго читаним секвенцама.
2. Квантификација алтернативног спајања на нивоу изоформе
Експресија изоформи задржавања интрона (ИР) у СФ3Б1К700Еи СФ3Б1WTсу квантификовани на основу секвенци нанопора, откривајући глобалну регулацију ИР изоформа у СФ3Б1К700Е.
Референца
Танг АД, Соулетте ЦМ, Барен МЈВ, ет ал.Карактеризација транскрипта пуне дужине мутације СФ3Б1 код хроничне лимфоцитне леукемије открива смањење регулације задржаних интрона [Ј].Натуре Цоммуницатионс.
