METAGENOMIA
Gjenomet e plota, të mbyllura bakteriale nga mikrobiomet duke përdorur sekuencën e nanoporeve
Sekuenca Nanopore |Metagjenomika |MAGs |Qarkullimi i gjenomit bakterial |Mikrobiotë e zorrëve
Pikat kryesore
1.Një metodë e re për nxjerrjen e fragmenteve të gjata të ADN-së u prezantua në këtë studim, e cila arriti nxjerrjen e mikrogramit të ADN-së së pastër, HMW, e përshtatshme për sekuencën e lexuar gjatë nga 300 mg jashtëqitje.
2. Në këtë studim u prezantua një rrjedhë pune e montimit, Torno, ku MAG-të grumbulloheshin me lexime të gjata dhe korrigjoheshin me lexime të shkurtra.
3. Torno u vlerësua me përzierje model.7 nga 12 baktere u grumbulluan me sukses në kontigra të vetme dhe 3 u grumbulluan në katër ose më pak kontige.
4. Torno u aplikua më tej në mostrat e jashtëqitjes, të cilat gjeneruan 20 gjenome të qarkulluara, duke përfshirë Prevotella copri dhe kandidatin Cibiobacter sp., të cilat njiheshin si të pasura me elementë gjenetikë të lëvizshëm.
Arritja kryesore
Protokolli i nxjerrjes për ADN HWM
Studimet metagjenomike të zorrëve të bazuara në sekuencë të lexuara gjatë kanë vuajtur prej kohësh nga ngurtësia në nxjerrjen e ADN-së me peshë të lartë molekulare (HMW) nga jashtëqitja.Në këtë studim, u prezantua një protokoll ekstraktimi i bazuar në enzimë për të shmangur prerjen e gjerë me rrahje rruaza në metodat tradicionale.Siç tregohet në figurën e mëposhtme, mostrat fillimisht u trajtuan me një koktej enzimash, duke përfshirë enzimën litike, MetaPolyzyme, etj. për të degraduar muret qelizore.ADN-ja e lëshuar u nxor nga sistemi fenol-kloroform, i ndjekur nga tretja e Proteinazës K dhe RNase A, pastrimi i bazuar në kolonë dhe përzgjedhja e madhësisë SPRI.Kjo metodë arriti të prodhojë mikrogramë të ADN-së HMW nga 300 m jashtëqitje, e cila plotëson kërkesat e sekuencave të lexuara gjatë si në cilësi ashtu edhe në sasi.
Figura 1. Skema e nxjerrjes së ADN-së HWM
Skema e rrjedhës së torno
Siç përshkruhet në figurën e mëposhtme, Torno përmban procesin ekzistues të procesit të thirrjes bazë të papërpunuar duke përdorur Guppy.Dy montime të lexuara gjatë prodhohen më pas nga Flye dhe Canu veçmas, të ndjekura nga zbulimi dhe heqja e montimit të gabuar.Dy nën-asambletë janë bashkuar me Quickmerge.Pas bashkimit, montimet e mëdha në nivelin megabazë kontrollohen më pas për qarkullim.Më pas, përpunimi i konsensusit për këto asamble përpunohet me lexime të shkurtra.Gjenomet bakteriale të montuara përfundimtare përpunohen për zbulimin dhe heqjen përfundimtare të mos-montimit.
Figura 2. Skema e rrjedhës së montimit të torno
Vlerësimi i torno me përzierje të baktereve tallëse
Një përzierje standarde ATCC 12-specie që përfshin baktere Gram-pozitive dhe Gram-negative u përdor për të vlerësuar performancën e platformës së sekuencës së nanoporeve dhe torno në montimin MAG.Një total prej 30.3 Gb të dhëna u gjeneruan nga platforma nanopore me N50 prej 5.9 kb.Torno përmirësoi kryesisht montimin N50 në 1,6 deri në 4 herë në krahasim me mjetet e tjera të montimit të lexuara gjatë dhe 2 deri në 9 herë në krahasim me veglat e montimit hibrid.Nga 12 gjenomet bakteriale, shtatë u mblodhën në kontigra të vetme (Figura 3. Cirk me pikë të zezë).Tre të tjera u grumbulluan në katër ose më pak kontigra, në të cilat montimi më i paplotë përmbante 83% të gjenomit në një kontig të vetëm.
Figura 3. Asambletë e gjenomit në një përzierje bakteriale të përcaktuar me 12 lloje
Aplikimi i Tornos në mostrat e jashtëqitjes
Kjo metodë u aplikua më tej në mostrat e jashtëqitjes njerëzore për të krahasuar identifikimin e organizmit dhe afërsinë e montimit me metodat ekzistuese, analizat e bazuara në renë leximi dhe leximi të shkurtër.Nga tre mostrat e përfshira, ekstraktimi i ri i bazuar në enzimë dha të paktën 1 μg për 300 mg të masës hyrëse.Sekuenca nanopore e këtyre ADN-së HMW gjeneroi lexime të gjata me N50 prej 4,7 kb, 3,0 kb dhe 3,0 kb respektivisht.Veçanërisht, metoda aktuale tregon potencial të madh në zbulimin e mikrobeve në krahasim me metodat ekzistuese.Diversiteti alfa relativisht më i lartë i nivelit të specieve u shfaq këtu në krahasim me renë e shkurtër të leximit dhe leximit.Për më tepër, të gjitha gjinitë nga analizat e leximit të shkurtër, madje edhe organizmat gram-pozitiv zakonisht rezistente ndaj lizës, u gjetën me këtë metodë.
Figura 4. Diversiteti alfa dhe komponentët taksonomikë të përcaktuar nga metodat Nanopore, me lexim të shkurtër dhe në renë e leximit
Torno dha një montim të plotë N50 shumë më të gjatë sesa montimi me lexim të shkurtër dhe në renë leximi, pavarësisht nga një hyrje tre deri në gjashtë herë më e ulët e të dhënave të papërpunuara.Draft gjenomet u prodhuan me lidhje të vazhdueshme, në të cilën draftet u klasifikuan në "me cilësi të lartë" ose "të pjesshme" bazuar në plotësinë, kontaminimin, gjenet bazë me një kopje, etj. Asambleja e lexuar gjatë tregoi afërsi shumë më të lartë me kosto më të ulët krahasuar për të lexuar shkurt dhe për të lexuar në renë kompjuterike.
Figura 5. Pajtueshmëria e montimit për organizëm të secilës metodë
Për më tepër, qasja e tanishme e montimit është e aftë të japë gjenome të mbyllura rrethore.Në mostrat e jashtëqitjes, u mblodhën tetë gjenome me cilësi të lartë, me një kontig dhe pesë prej tyre arritën qarkullim të saktë.Qasja e lexuar gjatë tregoi gjithashtu aftësi mbresëlënëse në zgjidhjen e elementeve të përsëritura në gjenom.qarkulluarP. coprigjenomi u krijua nga kjo qasje, e cila dihet se përmban një shkallë të lartë të përsëritjes së sekuencës.Asambleja më e mirë e këtij gjenomi nga rea e leximit të shkurtër dhe e leximit nuk e kaloi kurrë N50 prej 130 kb, edhe me një thellësi mbulimi prej 4800X.Këta elementë të numrit të lartë të kopjeve u zgjidhën plotësisht me qasjen e leximit të gjatë, e cila shpesh gjendej në pikat e ndërprerjes së asambleve të leximit të shkurtër ose të resë së lexuar.Një tjetër gjenom i mbyllur u raportua në këtë studim, i cili besohej të ishte një anëtar i përshkruar së fundmiCibiobakterklade.Pesë fagë të supozuar u identifikuan në këtë asamble të mbyllur, që variojnë nga 8.5 në 65.9 kb.
Figura 6. Diagrami circos i gjenomave të mbyllura të P.copri dhe Cibiobacter sp.
Referenca
Moss, EL, Maghini, DG dhe Bhatt, AS (2020).Gjenomet e plota, të mbyllura bakteriale nga mikrobiomet duke përdorur sekuencën e nanoporeve.Bioteknologjia e natyrës,38(6), 701-707.
Teknika dhe Pikat kryesore synon të ndajë aplikimin më të fundit të suksesshëm të teknologjive të ndryshme të renditjes me performancë të lartë në arena të ndryshme kërkimore, si dhe idetë e shkëlqyera në dizajnimin eksperimental dhe nxjerrjen e të dhënave.
Koha e postimit: Jan-07-2022