METAGENOMIKA
Popolni, zaprti bakterijski genomi iz mikrobiomov z uporabo sekvenciranja nanopor
Sekvenciranje nanopor |Metagenomika |MAGs |Kroženje bakterijskega genoma |Črevesna mikrobiota
Poudarki
1. V tej študiji je bila predstavljena nova metoda za ekstrakcijo dolgih fragmentov DNA, ki je dosegla ekstrakcijo mikrogramov čiste, HMW DNA, primerne za dolgotrajno sekvenciranje iz 300 mg blata
2. V tej študiji je bil predstavljen delovni tok sestavljanja, Lathe, kjer so bili MAG-ji sestavljeni z dolgimi branji in popravljeni s kratkimi branji.
3. Stružnica je bila ocenjena z lažno mešanico.7 od 12 bakterij je bilo uspešno sestavljenih v posamezne kontige, 3 pa v štiri ali manj kontigov.
4.Lathe je bil nadalje uporabljen za vzorce blata, ki so ustvarili 20 krožnih genomov, vključno s Prevotella copri in kandidatom Cibiobacter sp., ki so bili znani po tem, da so bogati z mobilnimi genetskimi elementi.
Glavni dosežek
Protokol ekstrakcije za HWM DNA
Dolgo berljive metagenomske študije črevesja, ki temeljijo na sekvenciranju, so dolgo trpele zaradi trdote pri ekstrakciji DNK z visoko molekulsko maso (HMW) iz blata.V tej študiji je bil uveden protokol ekstrakcije na osnovi encimov, da bi se izognili obsežnemu striženju z udarjanjem kroglic pri tradicionalnih metodah.Kot je prikazano na naslednji sliki, so bili vzorci najprej obdelani s koktajlom encimov, vključno z litičnim encimom, MetaPolyzyme itd., da se razgradijo celične stene.Sproščeno DNK smo ekstrahirali s sistemom fenol-kloroform, čemur je sledila razgradnja s proteinazo K in Rnazo A, čiščenje na podlagi kolone in izbira velikosti SPRI.Ta metoda je uspela pridobiti mikrograme HMW DNK iz 300 m blata, ki izpolnjuje dolgotrajne zahteve glede sekvenciranja tako glede kakovosti kot količine.
Slika 1. Shema ekstrakcije DNK HWM
Shema poteka stružnice
Kot je opisano na naslednji sliki, Lathe vsebuje obstoječi proces neobdelanega procesa osnovnega klica z uporabo Guppyja.Flye in Canu nato ločeno izdelata dva sklopa za dolgo branje, čemur sledi odkrivanje in odstranitev napačnega sestavljanja.Oba podsklopa sta združena s funkcijo quickmerge.Po združitvi se veliki sklopi na megabazni ravni nato preverijo glede kroženja.Nato se izboljšanje soglasja o teh sklopih obdela s kratkimi branji.Končno sestavljeni bakterijski genomi se obdelajo za končno odkrivanje in odstranitev napačne sestave.
Slika 2. Shema poteka sklopa stružnice
Ocena stružnice z lažno mešanico bakterij
Standardna mešanica 12 vrst ATCC, ki je vsebovala tako po Gramu pozitivne kot po Gramu negativne bakterije, je bila uporabljena za ovrednotenje delovanja platforme za sekvenciranje nanopor in stružnice v sestavi MAG.Platforma nanopore z N50 5,9 kb je ustvarila skupno 30,3 Gb podatkov.Stružnica je v veliki meri izboljšala montažo N50 na 1,6- do 4-krat v primerjavi z drugimi dolgo berljivimi montažnimi orodji in 2- do 9-krat v primerjavi s hibridnimi montažnimi orodji.Od 12 bakterijskih genomov je bilo sedem sestavljenih v posamezne kontige (slika 3. Circos s črno piko).Še trije so bili sestavljeni v štiri ali manj kontigov, pri čemer je najbolj nepopoln sklop vseboval 83 % genoma v enem kontigu.
Slika 3. Sestavi genoma v definirani mešanici bakterij 12 vrst
Uporaba stružnice v vzorcih blata
Ta metoda je bila nadalje uporabljena pri vzorcih človeškega blata, da bi primerjali identifikacijo organizma in sosednost sestavljanja z obstoječimi metodami, analizo v oblaku branja in analizo na podlagi kratkega branja.Iz treh vključenih vzorcev je nova ekstrakcija na osnovi encimov dala najmanj 1 μg na 300 mg vhodne mase.Sekvenciranje nanopor te HMW DNA je ustvarilo dolge odčitke z N50 4,7 kb, 3,0 kb oziroma 3,0 kb.Predvsem je sedanja metoda pokazala velik potencial pri odkrivanju mikrobov v primerjavi z obstoječimi metodami.Tu je bila prikazana razmeroma večja alfa raznolikost na ravni vrste v primerjavi s kratkim branjem in branjem v oblaku.Poleg tega so bili s to metodo pridobljeni vsi rodovi iz analize kratkega branja, tudi tipično na lizo odporni po Gramu pozitivni organizmi.
Slika 4. Raznolikost alfa in taksonomske komponente, določene z metodami Nanopore, kratkega branja in branja v oblaku
Lathe je dal veliko daljši celotni sklop N50 kot sklop za kratko branje in branje v oblaku, kljub tri- do šestkrat manjšemu vnosu neobdelanih podatkov.Osnutki genomov so bili izdelani s contig binningom, pri katerem so bili osnutki razvrščeni v »visokokakovostne« ali »delne« na podlagi popolnosti, kontaminacije, ene kopije jedrnih genov itd. za kratko branje in branje v oblaku.
Slika 5. Sosednost vsake metode po posameznih organizmih
Poleg tega je sedanji pristop sestavljanja sposoben dati zaprte, krožne genome.V vzorcih blata je bilo sestavljenih osem visokokakovostnih genomov z enim kontigom in pet od teh je doseglo natančno cirkularizacijo.Pristop z dolgo branjem je pokazal tudi impresivno zmogljivost pri razreševanju ponavljajočih se elementov v genomih.CirkulariziranoP. coprigenoma je bil ustvarjen s tem pristopom, za katerega je znano, da vsebuje visoko stopnjo ponavljanja zaporedja.Najboljši sklop tega genoma s kratkim branjem in bralnim oblakom nikoli ni presegel N50 130 kb, tudi z globino pokritosti 4800X.Ti elementi z velikim številom kopij so bili v celoti razrešeni s pristopom dolgotrajnega branja, ki se pogosto nahaja na prelomnih točkah sklopov za kratko branje ali branje v oblaku.V tej študiji so poročali o drugem zaprtem genomu, za katerega se domneva, da je član nedavno opisanegaCibiobacterklada.V tem zaprtem sklopu je bilo identificiranih pet domnevnih fagov, ki segajo od 8,5 do 65,9 kb.
Slika 6. Circosov diagram zaprtih genomov P.copri in Cibiobacter sp.
Referenca
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Popolni, zaprti bakterijski genomi iz mikrobiomov z uporabo sekvenciranja nanopor.Naravna biotehnologija,38(6), 701-707.
Tehnika in poudarki želi deliti najnovejše uspešne uporabe različnih visoko zmogljivih tehnologij zaporedja v različnih raziskovalnih arenah ter briljantne zamisli na področju eksperimentalnega načrtovanja in podatkovnega rudarjenja.
Čas objave: 7. januarja 2022