ČLOVEŠKA GENOMIKA
naravna genetika
Sekvenciranje dolgotrajnega branja identificira ekspanzije ponovitev GGC v NOTCH2NLC, povezane z nevronsko intranuklearno inkluzijsko boleznijo
Ponovno zaporedje ONT |Illumina |Sekvenciranje celotnega eksoma |CRISPR-Cas9 ONT ciljno zaporedje |RNA-seq |Klicanje metilacije ONT 5mC
Poudarki
1. Z analizo povezav na veliki družini NIID sta bili identificirani dve povezani regiji.
2. Sekvenciranje dolgega branja na podlagi ONT in sekvenciranje ONT z obogatitvijo, posredovano s Cas-9, je odkrilo potencialni genetski vzrok za NIID, ponovitvene ekspanzije GGC v 5' UTR NOTCH2NLC.Ta študija je prvič poročala o ponavljajočih se ekspanzijah v genih, specifičnih za človeka, ki so se razvili s segmentnimi podvajanji.
3. Sekvenciranje RNK je razkrilo nenormalne protismiselne transkripte na začetku ali znotraj regij ponovitve ekspanzije GGC v NOTCH2NLC.
Ozadje
Nevronuklearna intranuklearna inkluzijska bolezen (NIID) je napredujoča in usodna nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna prisotnost eozinofilnih hialinskih intranuklearnih inkluzij v centralnem in perifernem živčnem sistemu.Njegove zelo spremenljive klinične manifestacije povzročajo velike težave pri diagnozi do uvedbe biopsije kože.Vendar metode, ki temeljijo na histopatologiji, še vedno trpijo zaradi napačne diagnoze, kar zahteva genetsko razumevanje NIID.
Dosežki
Analiza povezav
SNa veliki družini NIID (13 prizadetih in 7 neprizadetih članov) je bilo izvedeno sekvenciranje celotnega genoma (WGS) in celotnega eksoma (WES), ki temelji na sekvenciranju s pravim branjem.Analiza povezav na SNP-jih, ekstrahiranih iz teh podatkov, je razkrila le dve povezani regiji: regijo 3,5 Mb pri 1p36.31-p36.22 (največji LOD=2,32) in regijo 58,1 Mb pri 1p22.1-q21.3 (največji LOD: 4,21 ).Vendar pa v teh povezanih regijah niso identificirali nobenih patogenih SNP ali CNV.
GGC ponovi razširitve v NOTCH2NLC
Nsekvenciranje na osnovi anopore je bilo obdelano na 13 prizadetih in 4 neprizadetih članih iz 8 družin (še enega prizadetega člana je sekvencirala Pacbio platforma za dolgo branje sekvenc).Dolgo prebrani podatki so razkrili z boleznijo povezane ekspanzije ponovitev GGC v 5' UTR preslikave gena NOTCH2NLC na 58,1 Mb povezano regijo (slika 1).Te ponavljajoče se ekspanzije so bile ugotovljene tudi v vseh 40 sporadičnih primerih NIID, testiranih z RP-PCR.
Cas-9 posredovano ciljno sekvenciranje na nanoporni platformi je bilo uporabljeno za doseganje večje pokritosti branja pri ponovitvi NOTCH2NLC (100 X-1795 X).Ta konsenzna zaporedja so se dobro strinjala s prejšnjimi ugotovitvami o ponavljajočih se ekspanzijah GGC.Poleg tega so bile ponovitve {(GGA)n (GGC)n}n identificirane kot potencialni genetski marker za fenotip s prevladujočo šibkostjo (slika 2).
Slika 1. Ponovljena ekspanzija, povezana z boleznijo, identificirana na eksonu 1 izooblik NOTCH2NLC.
Slika 2. Soglasna zaporedja ponovitve NPTCH2NLC pri bolnikih z NIID z (*) ali brez fenotipa s prevladujočim šibkostjo
NGeni OTCH2NL so geni, specifični za človeka, za katere se domneva, da igrajo ključno vlogo pri evoluciji človeških možganov in nevroloških boleznih.Vendar trije geni, povezani z NOTCH2 (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB in NOTCH2NLC) z >99,1-odstotno istovetnostjo zaporedja, niso bili razrešeni do zadnje sestave človeškega genoma.Sekvenciranje brez sinteze in dolgega branja na platformi nanopor je pokazalo opazne prednosti pri razreševanju območij visoke podobnosti in (GGC)n ponovitev s 100-odstotno GC-bogato.
GGC ponovi razširitve v NOTCH2NLC
Tsekvenciranje rankriptoma je bilo obdelano na 2 prizadetih in 2 neprizadetih članih.Normalizirana globina branja je bila izračunana na smiselnih in protismiselnih verigah pred prvimi eksoni paralogov NOTCH2NL.Nenormalne protismiselne transkripte so našli samo v prizadetih primerih, ki se nahajajo na začetku ali znotraj območja ponavljajoče se ekspanzije (vijolični vrhovi v F1-14 in F1-16 na sliki 3.).Poleg tega je bilo identificiranih 54 DEG in vsi so bili obogateni z izrazi GO in MPO, povezanimi z nevronskimi funkcijami.
Slika 3. Normalizirana globina branja navzgor od prvega eksona NOTCH2NLC v neprizadetih (zgoraj) in prizadetih (spodaj) primerih.
tehnologija
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
Nanopore sekvenciranje se razlikuje od drugih platform za sekvenciranje po tem, da se nukleotidi berejo neposredno brez procesa sinteze DNA.Ko gre enoverižna DNA skozi proteinsko poro nano velikosti (nanopor), različni nukleotidi ustvarjajo različne ionske tokove, ki jih je mogoče zajeti in prenesti v zaporedje baz.Sama platforma za sekvenciranje ONT ne kaže očitne tehnične omejitve dolžine branja DNK.Zato so ultra dolgi odčitki (ULR) na voljo za sestavljanje genoma visoke kakovosti.Poleg tega ti izjemno dolgi odčitki, ki so dovolj dolgi, da prečkajo zapletene značilnosti zaporedja ali strukturne variacije, pomagajo premagati omejitve zaporedja kratkega odčitavanja tukaj.
Sekvenciranje nanopor
Identifikacija variacije strukture (SV).
Ssekvenciranje brez sinteze je v veliki meri ohranilo informacije o metilaciji DNA na predlogi.Metilirani A, T, C in G ustvarjajo različne ionske tokove od nemetiliranih, ki jih lahko neposredno prebere platforma.Sekvenciranje nanopor omogoča profiliranje celotnega genoma tako 5mC kot 6mA pri ločljivosti enega nukleotida.
Referenca
Jun Sone, et.al.Sekvenciranje dolgotrajnega branja identificira ekspanzije ponovitev GGC v NOTCH2NLC, povezane z nevronsko intranuklearno inkluzijsko boleznijo.Naravna genetika (2019)
Tehnika in poudarki želi deliti najnovejše uspešne uporabe različnih visoko zmogljivih tehnologij zaporedja v različnih raziskovalnih arenah ter briljantne zamisli na področju eksperimentalnega načrtovanja in podatkovnega rudarjenja.
Čas objave: 6. januarja 2022