TRANSKRIPTOMI
narave
KOMUNIKACIJE
Karakterizacija transkripta polne dolžine mutacije SF3B1 pri kronični limfocitni levkemiji razkriva znižanje regulacije zadržanih intronov
Celovečerni prepisi|Sekvenciranje nanopor|Analiza alternativnih izoform
Ozadje
SPoročali so, da so omatske mutacije v faktorju spajanja SF3B1 povezane z različnimi vrstami raka, vključno s kronično limfocitno levkemijo (CLL), uvealnim melanomom, rakom dojke itd. Poleg tega so kratkotrajne transkriptomske študije razkrile nenormalne vzorce spajanja, ki jih povzročajo mutacije SF3B1.Vendar pa so bile študije o teh alternativnih vzorcih spajanja dolgo omejene na raven dogodkov in pomanjkanje znanja na ravni izoform zaradi omejitve sestavljenih transkriptov za kratko branje.Tu je bila uvedena platforma za sekvenciranje nanopor za ustvarjanje transkriptov v polni dolžini, ki je omogočila raziskovanje izoform AS.
Eksperimentalno načrtovanje
Poskusi
Združevanje:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(mutacija K700E);3. Normalne B-celice
Strategija zaporedja:Sekvenciranje knjižnice MinION 2D, sekvenciranje knjižnice PromethION 1D;kratko branje podatkov iz istih vzorcev
Platforma za zaporedje:ONT MinION;ONT PromethION;
Bioinformatska analiza
Rezultati
Askupno 257 milijonov odčitkov je bilo ustvarjenih iz 6 vzorcev CLL in 3 B-celic.V povprečju je bilo 30,5 % teh branj prepoznanih kot celovečerni prepisi.
Falternativna analiza izooblike celotne dolžine RNA (FLAIR) je bila razvita za ustvarjanje niza izooblik z visoko stopnjo zaupanja.FLAIR lahko povzamemo kot:
Nanopore bere poravnavo: določi splošno strukturo transkripta na podlagi referenčnega genoma;
Spopravek spoja plice: popravite napake zaporedja (rdeče) z mestom spoja bodisi iz označenih intronov, intronov iz kratkobranih podatkov ali obojega;
Collapse: povzemite reprezentativne izooblike na podlagi spojnih verig (nabor prvega prehoda).Izberite isofrom z visoko stopnjo zaupanja na podlagi števila podpornih branj (prag: 3).
Slika 1. Analiza FLAIR za identifikacijo izooblik polne dolžine, povezanih z mutacijo SF3B1 pri CLL
FLAIR Identificiral 326.699 visokozanesljivih spojenih izooblik, od katerih je 90 % novih izooblik.Za večino teh neoznačenih izooblik je bilo ugotovljeno, da so nove kombinacije znanih spojnih spojin (142.971), medtem ko so ostale nove izooblike vsebovale bodisi ohranjen intron (21.700) ali nov ekson (3594).
Lzaporedja, ki se berejo, omogočajo identifikacijo mutantnih SF3B1-K700E spremenjenih mest spajanja na ravni izoforme.Ugotovljeno je bilo, da je 35 alternativnih 3'SS-jev in 10 alternativnih 5'SS-jev bistveno različno spojenih med SF3B1-K700E in SF3B1-WT.33 od 35 sprememb je bilo na novo odkritih z dolgo branimi sekvencami.V podatkih Nanopore je porazdelitev razdalje med 3'SS-ji, spremenjenimi s SF3B1-K700E, do vrhov kanoničnih mest okoli -20 bp, kar se bistveno razlikuje od kontrolne porazdelitve, podobno tistemu, o katerem so poročali pri zaporedjih kratkega branja CLL.Analizirane so bile izooblike gena ERGIC3, kjer je bilo ugotovljeno, da je nova izoforma, ki vsebuje proksimalno mesto spoja, večja v SF3B1-K700E.Tako proksimalni kot distalni 3'SS sta bila povezana z različnimi vzorci AS, ki ustvarjajo več izoform.
Slika 2. Alternativni 3' vzorci spajanja, identificirani s podatki o zaporedju nanopor
Analiza uporabe dogodkov IR je bila dolgo omejena na analizo, ki temelji na kratkem branju, zaradi zaupanja v identifikacijo in kvantifikacijo IR.Ekspresija izooblik IR v SF3B1-K700E in SF3B1-WT je bila kvantificirana na podlagi sekvenc nanopor, kar je razkrilo globalno znižano regulacijo izooblik IR v SF3B1-K700E.
Slika 4. Intenzivnost kmetijstva in omrežna povezljivost v treh sistemih kmetovanja (A in B);Analiza naključnega gozda (C) in razmerje med intenzivnostjo kmetijstva in kolonizacijo AMF (D)
Slika 3. Dogodki zadrževanja Introna so v CLL SF3B1-K700E močneje znižani
tehnologija
Nanopore Dolgo branje zaporedja
Nanopore sekvenciranje je tehnologija sekvenciranja električnega signala z eno molekulo v realnem času.
Ddvoverižna DNA ali RNA se bo vezala na nanoporozne beljakovine, ki so vgrajene v biofilm in se odvijajo pod vodstvom motoričnih beljakovin.
DNiti NA/RNA prehajajo skozi protein nanopornega kanala z določeno hitrostjo pod vplivom napetostne razlike.
Molekule ustvarjajo različne električne signale glede na kemično strukturo.
Rsprotno zaznavanje sekvenc je doseženo s klicanjem baze.
Izvedba sekvenciranja transkriptoma v polni dolžini
√ Nasičenost podatkov
Za doseganje primerljive nasičenosti podatkov je potrebnih 7-krat manj branj.
√ Identifikacija strukture transkripta
Identifikacija različnih strukturnih variant s konsenznim branjem celotne dolžine vsakega prepisa
√ Diferencialna analiza na ravni transkripta - Razkrijte spremembe, ki jih skrijejo kratki branji
Referenca
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV et al.Karakterizacija transkripta polne dolžine mutacije SF3B1 pri kronični limfocitni levkemiji razkriva znižanje regulacije zadržanih intronov [J].Nature Communications.
Tehnika in poudarki želi deliti najnovejše uspešne uporabe različnih visoko zmogljivih tehnologij zaporedja v različnih raziskovalnih arenah ter briljantne zamisli na področju eksperimentalnega načrtovanja in podatkovnega rudarjenja.
Čas objave: 8. januarja 2022