Celotna dolžina mRNA Sekvenciranje-Nanopore
Prednosti storitve
● Nizka pristranskost zaporedja
● Razkrivanje molekul cDNA polne dolžine
● Za enako število prepisov je potrebnih manj podatkov
● Identifikacija več izoform na gen
● Kvantifikacija izražanja na ravni izoforme
Specifikacije storitve
| Knjižnica | Platforma | Priporočeni prenos podatkov (Gb) | Kontrola kakovosti |
| cDNA-PCR (poly-A obogatena) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb/vzorec (odvisno od vrste) | Razmerje celotne dolžine >70 % Povprečna ocena kakovosti: Q10
|
Bioinformatske analize
●Obdelava neobdelanih podatkov
● Identifikacija prepisa
● Alternativno spajanje
● Kvantifikacija izražanja na ravni gena in ravni izoforme
● Analiza diferencialnih izrazov
● Opombe in obogatitev funkcij (DEG in DET)
Zahteve za vzorce in dostava
Vzorčne zahteve:
Nukleotidi:
| Konc. (ng/μl) | Količina (μg) | Čistost | Integriteta |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Na gelu je prikazana omejena ali nikakršna kontaminacija beljakovin ali DNK. | Za rastline: RIN≥7,0; Za živali: RIN≥7,5; 5,0≥28S/18S≥1,0; omejena ali brez osnovne višine |
Tkivo: Teža (suho): ≥1 g
*Za tkivo, manjše od 5 mg, priporočamo pošiljanje hitro zamrznjenega (v tekočem dušiku) vzorca tkiva.
Suspenzija celic: Število celic = 3×106- 1×107
*Priporočamo pošiljanje zamrznjenega celičnega lizata.V primeru, da je ta celica manjša od 5×105, priporočamo hitro zamrzovanje v tekočem dušiku, kar je prednostno za mikro ekstrakcijo.
Vzorci krvi: Volumen≥1 ml
Priporočena dostava vzorcev
Vsebnik: 2 ml centrifugalna epruveta (kositrna folija ni priporočljiva)
Označevanje vzorca: skupina + ponovitev, npr. A1, A2, A3;B1, B2, B3 ... ...
Pošiljka: 2、Suhi led: Vzorce je treba zapakirati v vrečke in zakopati v suhi led.
- Epruvete RNAstable: vzorce RNA lahko posušite v epruveti za stabilizacijo RNA (npr. RNAstable®) in jih pošljete pri sobni temperaturi.
Potek storitvenega dela
Nukleotidi:
Dostava vzorcev
Gradnja knjižnice
Zaporedje
Analiza podatkov
Poprodajne storitve
Potek storitvenega dela
Tkivo:
Oblikovanje eksperimenta
Dostava vzorcev
Ekstrakcija RNA
Gradnja knjižnice
Zaporedje
Analiza podatkov
Poprodajne storitve
1.Analiza diferencialnih izrazov - graf vulkana
Analiza diferencialne ekspresije se lahko obdela na ravni genov za identifikacijo različno izraženih genov (DEG) in na ravni izoform za identifikacijo diferencialno
izraženi prepisi (DET)
2.Hierarhična toplotna karta združevanja v gruče
3. Identifikacija in klasifikacija alternativnega spajanja
Astalavista lahko predvidi pet vrst alternativnih dogodkov spajanja.
4.Identifikacija dogodkov alternativne poliadenilacije (APA) in motiv pri 50 bp pred poli-A
Zadeva BMK
Alternativna identifikacija spajanja in kvantifikacija na ravni izoforme s sekvenciranjem transkriptoma v celotni dolžini nanopor
Objavljeno:Nature Communications, 2020
Strategija zaporedja:
Združevanje: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (mutacija K700E);3. Normalne B-celice
Strategija sekvenciranja: sekvenciranje knjižnice MinION 2D, sekvenciranje knjižnice PromethION 1D;kratko branje podatkov iz istih vzorcev
Platforma za sekvenciranje: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;
Ključni rezultati
1. Identifikacija alternativnega spajanja na ravni izoforme
Dolgo berljive sekvence omogočajo identifikacijo mutantnega SF3B1K700E- spremenjena mesta spajanja na ravni izoforme.Za 35 alternativnih 3'SS in 10 alternativnih 5'SS je bilo ugotovljeno, da so bistveno različno spojeni med SF3B1K700Ein SF3B1WT.33 od 35 sprememb je bilo na novo odkritih z dolgo branimi sekvencami.
2. Kvantifikacija alternativnega spajanja na ravni izoforme
Izražanje izooblik intronske retencije (IR) v SF3B1K700Ein SF3B1WTso bile kvantificirane na podlagi sekvenc nanopor, kar je razkrilo globalno znižano regulacijo izooblik IR v SF3B1K700E.
Referenca
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV et al.Karakterizacija transkripta polne dolžine mutacije SF3B1 pri kronični limfocitni levkemiji razkriva znižanje regulacije zadržanih intronov [J].Nature Communications.
