TRANSKRIPTOMIKY
prírody
KOMUNIKÁCIE
Celodĺžková transkriptová charakterizácia mutácie SF3B1 pri chronickej lymfocytovej leukémii odhaľuje downreguláciu zadržaných intrónov
Prepisy v plnej dĺžke|Sekvenovanie nanopórov|Alternatívna analýza izoforiem
Pozadie
SOmatické mutácie v zostrihovom faktore SF3B1 sa vo veľkej miere spájajú s rôznymi druhmi rakoviny, vrátane chronickej lymfocytovej leukémie (CLL), uveálneho melanómu, rakoviny prsníka atď.Štúdie o týchto alternatívnych vzorcoch zostrihu sa však dlho obmedzovali na úroveň udalostí a nedostatok vedomostí na úrovni izoforiem v dôsledku obmedzenia zostavených transkriptov na krátke čítanie.Tu bola zavedená platforma na sekvenovanie nanopórov na generovanie transkriptov v plnej dĺžke, čo umožnilo invertigáciu na izoformách AS.
Experimentálny dizajn
Experimenty
Zoskupenie:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(mutácia K700E);3. Normálne B-bunky
Stratégia sekvenovania:sekvenovanie knižnice MinION 2D, sekvenovanie knižnice PromethION 1D;krátke čítanie údajov z rovnakých vzoriek
Sekvenčná platforma:ONT MinION;ONT PromethION;
Bioinformatická analýza
Výsledky
Acelkovo sa vygenerovalo 257 miliónov čítaní zo 6 vzoriek CLL a 3 B-buniek.V priemere 30,5 % týchto čítaní bolo identifikovaných ako prepisy v plnej dĺžke.
Fbola vyvinutá alternatívna analýza izoforiem RNA (FLAIR) s úplnou dĺžkou, aby sa vytvoril súbor vysoko spoľahlivých izoforiem.FLAIR možno zhrnúť takto:
Nanopore reads alignment: identifikovať všeobecnú štruktúru transkriptu na základe referenčného genómu;
Skorekcia plice junction: opravte sekvenčné chyby (červená) s miestom zostrihu buď z anotovaných intrónov, intrónov z krátkych dát alebo oboch;
Collapse: zhrnutie reprezentatívnych izoforiem na základe spojovacích spojovacích reťazcov (sada prvého prechodu).Vyberte si isood s vysokou spoľahlivosťou na základe počtu podporných čítaní (Threshold: 3).
Obrázok 1. Analýza FLAIR na identifikáciu celodĺžkových izoforiem spojených s mutáciou SF3B1 pri CLL
FLAIR Identifikovaných 326 699 vysoko spoľahlivých zostrihnutých izoforiem, z ktorých 90 % sú nové izoformy.Zistilo sa, že väčšina z týchto neanotovaných izoforiem sú novými kombináciami známych zostrihových spojení (142 971), zatiaľ čo ostatné nové izoformy obsahovali buď zachovaný intrón (21 700) alebo nový exón (3594).
Long-read sekvencie umožňujú identifikáciu mutantných SF3B1-K700E - zmenených zostrihových miest na úrovni izoforiem.Zistilo sa, že 35 alternatívnych 3'SS a 10 alternatívnych 5'SS je významne rozdielne zostrihaných medzi SF3B1-K700E a SF3B1-WT.33 z 35 zmien bolo novoobjavených dlho čítanými sekvenciami.V údajoch Nanopore je distribúcia vzdialenosti medzi 3'SS zmenenými SF3B1-K700E k vrcholom kanonických miest okolo -20 bp, čo sa výrazne líši od kontrolnej distribúcie, podobne ako to, čo bolo hlásené v krátkych sekvenciách CLL.Analyzovali sa izoformy génu ERGIC3, pričom nová izoforma obsahujúca proximálne miesto zostrihu sa našla v hojnejšom množstve v SF3B1-K700E.Proximálne aj distálne 3'SS boli spojené s odlišnými vzormi AS vytvárajúcimi viacero izoforiem.
Obrázok 2. Alternatívne 3′ zostrihové vzory identifikované údajmi o sekvenovaní nanopórov
Analýza použitia udalosti IR bola dlho obmedzená v analýze založenej na krátkom čítaní kvôli dôvere v identifikáciu a kvantifikáciu IR.Expresia IR izoforiem v SF3B1-K700E a SF3B1-WT bola kvantifikovaná na základe nanopórových sekvencií, čo odhalilo globálnu down-reguláciu IR izoforiem v SF3B1-K700E.
Obrázok 4. Intenzita poľnohospodárstva a sieťová konektivita v rámci troch poľnohospodárskych systémov (A a B);Náhodná analýza lesa (C) a vzťah medzi intenzitou poľnohospodárstva a kolonizáciou AMF (D)
Obrázok 3. Udalosti prenájmu intrónov sú výraznejšie downregulované v CLL SF3B1-K700E
Technológia
Nanopore Long-read Sequencing
Nanopore sekvenovanie je technológia sekvenovania elektrických signálov v reálnom čase s jednou molekulou.
Ddvojvláknová DNA alebo RNA sa bude viazať na nanoporézny proteín uložený v biofilme a odvíjajúci sa pod vedením motorického proteínu.
DVlákna NA/RNA prechádzajú cez nanopórový kanálový proteín určitou rýchlosťou pri pôsobení rozdielu napätia.
Molekuly generujú rôzne elektrické signály podľa chemickej štruktúry.
Rdetekcia sekvencií v reálnom čase sa dosiahne volaním bázy.
Vykonávanie sekvenovania transkriptómu v plnej dĺžke
√ Sýtosť dát
Na dosiahnutie porovnateľnej sýtosti údajov je potrebných 7-krát menej čítaní.
√ Identifikácia štruktúry prepisu
Identifikácia rôznych štrukturálnych variantov s konsenzuálnym čítaním celej dĺžky každého transkriptu
√ Diferenciálna analýza na úrovni prepisu - Odhaľte zmeny skryté krátkym čítaním
Odkaz
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV a kol.Celodĺžková transkriptová charakterizácia mutácie SF3B1 pri chronickej lymfocytovej leukémii odhaľuje downreguláciu zadržaných intrónov[J].Prírodné komunikácie.
Tech and Highlights sa zameriava na zdieľanie najnovších úspešných aplikácií rôznych vysokovýkonných sekvenčných technológií v rôznych oblastiach výskumu, ako aj skvelých nápadov v experimentálnom dizajne a dolovaní údajov.
Čas odoslania: Jan-08-2022