VYŽADUJE CELÝ GENOM
Genomické monitorovanie SARS-CoV-2 odhaľuje variant delécie Nsp1, ktorý moduluje odpoveď interferónu typu I
Nanopore |Illumina |Resekvenovanie celého genómu |metagenomika |RNA-Seq |Sanger
Spoločnosť Biomarker Technologies poskytla technickú podporu pri sekvenovaní vzoriek v tejto štúdii.
Zvýraznenie
1. Sekvenovanie genómu SARS-CoV-2 a fylognetická analýza identifikuje 35 rekurentných mutácií vrátane 31 SNP a 4 Indelov.
2. Potenciálne odhaľuje spojenie so 117 klinickými fenotypmi
dôležité mutácie.
∆500-532 v kódujúcej oblasti Nsp1 koreluje s nižším vírusom
3.záťaž a sérový IFN-β.
4. Vírusové izoláty s mutáciou ∆500-532 indukujú nižšie IFN-I
odpoveď v infikovaných bunkách.
Experimentálny dizajn
Úspechy
1. Epidemiologický a genomický dohľad COVID-19
Klinické údaje sa zbierali v provincii Sichuan v Číne počas obdobia prepuknutia choroby od 22. januára 2020 do 20. februára 2020. Testy qPCR v Sichuane potvrdili celkovo 538 prípadov COVID-19, z ktorých 28,8 % pochádzalo z provincie kapitál.Počet potvrdených prípadov v S'-čchuane exponenciálne vzrástol, pričom vrchol dosiahol 30. januára.Údaje tiež potvrdili, že sociálny odstup môže byť kľúčovým faktorom pri prevencii šírenia vírusu.
Obrázok 1. Epidemiologická štúdia COVID-19 v provincii Sichuan v Číne
2. Konštrukcia genómu SARS-CoV-2 a identifikácia variantov
S multiplexnou PCR amplifikáciou nasledovanou sekvenovaním nanopórov bolo vytvorených celkom 310 takmer alebo čiastočne kompletných genómov od 248 pacientov s pribl.80 % genómov pokrytých 10 čítaniami (priemerná hĺbka: 0,39 M čítaní na vzorku).
Obrázok 2. Frekvencia jednotlivých variantov v kohorte Sichuan
Celkovo bolo identifikovaných 104 SNP a 18 Indelov z genómov SARS-CoV-2, v ktorých bolo 31 SNP a 4 Indel identifikované ako rekurentné genetické varianty.Porovnaním so 169 vzorkami z Wu-chanu a s 81 391 vysokokvalitnými sekvenciami verejného genómu v GISAID bolo 29 z 35 nájdených variantov prezentovaných na iných kontinentoch.Predovšetkým sa zistilo, že štyri varianty vrátane ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 a T13243C sa vyskytujú iba v Sichuane a Wu-chane a chýbajú v údajoch GISAID, čo naznačuje, že tieto varianty boli s veľkou pravdepodobnosťou importované z Wu-chanu, ktoré spĺňajú cestovné záznamy pacientov.
Evolučná analýza metódou maximálnej pravdepodobnosti (ML) a bayesovskými molekulárnymi hodinami bola spracovaná na 88 nových vírusoch zo Sichuanu a 250 upravených genómoch z iných oblastí.Genómy s ∆500-532 (delécie v kódujúcej oblasti Nsp1) sa našli vo fylogenetickom strome riedko distribuované.Analýza haplotypov na variantoch Nsp1 identifikovala 5 z nich z viacerých miest.Tieto výsledky naznačujú, že ∆500-532 sa vyskytli vo viacerých mestách a mohli byť dovezené viackrát z Wuhanu.
Obrázok 2. Opakujúce sa genetické varianty a fylogenetická analýza v genómoch SARS-CoV-2
3. Asociácia rekurentných genetických variantov s klinickými dôsledkami
117 klinických fenotypov bolo spojených so závažnosťou COVID-19, pričom 19 fenotypov súvisiacich so závažnosťou bolo klasifikovaných do závažných a nezávažných znakov.Vzťah medzi týmito znakmi a 35 rekurentnými genetickými variantmi bol vizualizovaný v bi-klastrovej tepelnej mape.Analýza obohatenia podobná GSEA ukázala, že ∆500-532 negatívne koreluje s ESR, sérovým IFN-β a počtom CD3+CD8+ T buniek v krvi.Okrem toho testy qPCR ukázali, že pacienti infikovaní vírusom nesúcim ∆500-532 mali najvyššiu hodnotu Ct, tj najnižšiu vírusovú záťaž.
Obrázok 3. Asociácie 35 rekurentných genetických variantov s klinickými fenotypmi
4. Validácia klinických fenotypov spojených s vírusovou mutáciou
Aby sme pochopili vplyvy ∆500-532 na funkcie Nsp1, bunky HEK239T boli transfekované plazmidmi exprimujúcimi plnú dĺžku, WT Nsp1 a mutantné formy s deléciami.Profily transkriptómov každej ošetrenej bunky HEK239T boli spracované na analýzu PCA, čo ukazuje, že delečné mutanty sa zhlukovali relatívne bližšie a boli významne odlišné od WT Nsp1.Gény, ktoré boli v mutantoch významne upregulované, boli obohatené hlavne o „biosyntetický/metabolický proces peptidov“, „biogenézu ribonukleoproteínového komplexu“, „zameranie proteínu na membránu/ER“ atď.
Obrázok 4. Analýza transkriptómu na bunkách HEK239T transfekovaných WT Nsp1 a bunkám s deléciami
Vplyv delécií na odpoveď IFN-1 bol tiež testovaný v štúdii s nadmernou expresiou.Ukázalo sa, že všetky testované delécie znižujú odpoveď IFN-1 v transfekovaných bunkách HEK239T a A549 na úrovni transkriptómu aj na úrovni proteínu.Je zaujímavé, že výrazne down-regulované gény v deléciách boli obohatené o „obrannú odpoveď na vírus“, „replikáciu vírusového genómu“, „reguláciu transkripcie pomocou RNA polymerázy II“ a „odpoveď na interferón typu I“.
Obrázok 5. Dolná regulácia interferónových signálnych dráh v mutante ∆500-532
V tejto štúdii bol vplyv týchto delécií na vírus ďalej potvrdený štúdiami vírusovej infekcie.Vírusy s určitými mutantmi boli izolované z klinických vzoriek a infikované bunkami Calu-3.Podrobné výsledky štúdie vírusových infekcií si môžete prečítať v článku.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Odkaz
Lin J, Tang C, Wei H a kol.Genomické monitorovanie SARS-CoV-2 odhaľuje variant delécie Nsp1, ktorý moduluje odpoveď interferónu typu I[J].Bunkový hostiteľ a mikrób, 2021.
Novinky a najvýznamnejšie udalosti sa zameriava na zdieľanie najnovších úspešných prípadov s Biomarker Technologies, zachytávanie nových vedeckých úspechov, ako aj významných techník použitých počas štúdie.
Čas odoslania: Jan-06-2022