Dlhé nekódujúce sekvenovanie - Illumina
Výhody služby
● Servisné výhody
● Bunkové a tkanivové špecifické
● Špecifické štádium vyjadruje a prezentuje dynamickú výrazovú zmenu
● Presné vzorce vyjadrenia času a priestoru
● Spoločná analýza s údajmi mRNA.
● Doručovanie výsledkov na báze BMKCloud: Na platforme je k dispozícii prispôsobené dolovanie údajov.
● Popredajné služby platné 3 mesiace po dokončení projektu
Vzorové požiadavky a doručenie
| Knižnica | Plošina | Odporúčané údaje | Dáta QC |
| deplécia rRNA | Illumina PE150 | 10 Gb | Q30 ≥ 85 % |
| Konc. (ng/μl) | množstvo (μg) | Čistota | bezúhonnosť |
| ≥ 100 | ≥ 0,5 | OD260/280 = 1,7-2,5 OD260/230 = 0,5-2,5 Obmedzená alebo žiadna kontaminácia proteínmi alebo DNA na géli. | Pre rastliny: RIN≥6,5; Pre zvieratá: RIN≥7,0; 5,0≥28S/18S≥1,0; obmedzená alebo žiadna základná elevácia |
Nukleotidy:
Tkanivo: Hmotnosť (suché): ≥1 g
*Pre tkanivo menšie ako 5 mg odporúčame zaslať bleskovo zmrazenú (v tekutom dusíku) vzorku tkaniva.
Bunková suspenzia: Počet buniek = 3 x 107
*Odporúčame zaslať zmrazený bunkový lyzát.V prípade, že počet buniek je menší ako 5×105, odporúča sa rýchle zmrazenie v tekutom dusíku.
Vzorky krvi:
PA×geneBloodRNATube;
6 ml TRIzolu a 2 ml krvi (TRIzol: Krv = 3:1)
Odporúčané doručenie vzorky
Nádoba: 2 ml centrifugačná skúmavka (neodporúča sa cínová fólia)
Označenie vzoriek: Skupina+replikácia napr. A1, A2, A3;B1, B2, B3......
Náklad:
1. Suchý ľad: Vzorky je potrebné zabaliť do vriec a pochovať v suchom ľade.
2. Skúmavky RNAstable: Vzorky RNA možno vysušiť v skúmavke na stabilizáciu RNA (napr. RNAstable®) a odoslať pri izbovej teplote.
Tok servisných prác
Dizajn experimentu
Doručenie vzorky
Extrakcia RNA
Výstavba knižnice
Sekvenovanie
Analýza dát
Popredajné služby
Bioinformatika
1. Klasifikácia LncRNA
LncRNA predpovedané štyrmi vyššie uvedenými softvérmi boli klasifikované do 4 kategórií: lincRNA, anti-sense-LncRNA, intronic-LncRNA;sense-LncRNA.Klasifikácia LncRNA bola uvedená v histograme nižšie.
Klasifikácia LncRNA
2.Cis-cielené gény analýzy obohatenia DE-lncRNA
ClusterProfiler bol použitý pri analýze obohatenia GO na cis-cielených génoch diferencovane exprimovanej lncRNA (DE-lncRNA), z hľadiska biologických procesov, molekulárnych funkcií a bunkových komponentov.Analýza obohatenia GO je proces na identifikáciu výrazne obohatených GO termínov zameraných na DEG v porovnaní s celým genómom.Obohatené výrazy boli prezentované v histograme, bublinovom grafe atď., ako je uvedené nižšie.
Cis-cielené gény analýzy obohatenia DE-lncRNA - bublinový graf
3. Porovnaním dĺžky, počtu exónov, ORF a množstva expresie mRNA a lncRNA môžeme pochopiť rozdiely v štruktúre, sekvencii atď. medzi nimi a tiež overiť, či nami predpovedaná nová lncRNA zodpovedá všeobecným charakteristikám.
Prípad BMK
Deregulovaný profil expresie lncRNA v myších pľúcnych adenokarcinómoch s mutáciou KRAS-G12D a knockoutom P53
Publikovaný:Journal of Cellular and Molecular Medicine,2019
Stratégia sekvenovania
Illumina
Zbierka vzoriek
NONMMUT015812-knockdown KP (shRNA-2) bunky a negatívne kontrolné (sh-Scr) bunky sa získali na 6. deň špecifickej vírusovej infekcie.
Kľúčové výsledky
Táto štúdia skúma aberantne exprimované lncRNA v myšom pľúcnom adenokarcinóme s knockoutom P53 a mutáciou KrasG12D.
1,6424 lncRNA bolo rozdielne exprimovaných (≥ 2-násobná zmena, P < 0,05).
2. Spomedzi všetkých 210 lncRNA (FC≥8) bola expresia 11 lncRNA regulovaná P53, 33 lncRNA pomocou KRAS a 13 lncRNA hypoxiou v primárnych KP bunkách.
3.NONMMUT015812, ktorý bol pozoruhodne up-regulovaný v myšom pľúcnom adenokarcinóme a negatívne regulovaný reexpresiou P53, bol detegovaný na analýzu jeho bunkovej funkcie.
4. Knockdown NONMMUT015812 pomocou shRNA znížil proliferačné a migračné schopnosti KP buniek.NOMMUT015812 bol potenciálny onkogén.
 Analýza KEGG dráhy rozdielne exprimovaných génov v NONMMUT015812-knockdown KP bunkách |  Analýza génovej ontológie rozdielne exprimovaných génov v NONMMUT015812-knockdown KP bunkách |
Odkaz
Deregulovaný profil expresie lncRNA v myších pľúcnych adenokarcinómoch s mutáciou KRAS-G12D a knockoutom P53 [J].Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2019, 23(10).DOI: 10.1111/jcmm.14584
