Sekvenovanie mRNA s plnou dĺžkou - nanopór
Výhody služby
● Skreslenie nízkej sekvencie
● Odhalenie molekúl cDNA plnej dĺžky
● Na pokrytie rovnakého počtu prepisov je potrebných menej údajov
● Identifikácia viacerých izoforiem na gén
● Kvantifikácia expresie na úrovni izoforiem
Špecifikácie služby
| Knižnica | Plošina | Odporúčaný výťažok dát (Gb) | Kontrola kvality |
| cDNA-PCR (obohatený o Poly-A) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb/vzorka (v závislosti od druhu) | Pomer po celej dĺžke ＞ 70 % Priemerné skóre kvality: Q10
|
Bioinformatické analýzy
●Spracovanie nespracovaných údajov
● Identifikácia prepisu
● Alternatívne spájanie
● Kvantifikácia expresie na úrovni génu a na úrovni izoforiem
● Analýza diferenciálnej expresie
● Anotácia a obohatenie funkcií (DEG a DET)
Vzorové požiadavky a doručenie
Vzorové požiadavky:
Nukleotidy:
| Konc. (ng/μl) | množstvo (μg) | Čistota | bezúhonnosť |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280 = 1,7-2,5 OD260/230 = 0,5-2,5 Obmedzená alebo žiadna kontaminácia proteínmi alebo DNA na géli. | Pre rastliny: RIN≥7,0; Pre zvieratá: RIN≥7,5; 5,0≥28S/18S≥1,0; obmedzená alebo žiadna základná elevácia |
Tkanivo: Hmotnosť (suché): ≥1 g
*Pre tkanivo menšie ako 5 mg odporúčame zaslať bleskovo zmrazenú (v tekutom dusíku) vzorku tkaniva.
Bunková suspenzia: Počet buniek = 3 x 106- 1×107
*Odporúčame zaslať zmrazený bunkový lyzát.V prípade, že počet buniek je menší ako 5×105Odporúča sa rýchle zmrazenie v tekutom dusíku, čo je vhodnejšie na mikroextrakciu.
Vzorky krvi: Objem ≥ 1 ml
Odporúčané doručenie vzorky
Nádoba: 2 ml centrifugačná skúmavka (neodporúča sa cínová fólia)
Označenie vzoriek: Skupina+replikácia napr. A1, A2, A3;B1, B2, B3......
Zásielka: 2、Suchý ľad: Vzorky je potrebné zabaliť do vreciek a pochovať v suchom ľade.
- Skúmavky RNAstable: Vzorky RNA možno vysušiť v skúmavke na stabilizáciu RNA (napr. RNAstable®) a odoslať pri izbovej teplote.
Tok servisných prác
Nukleotidy:
Doručenie vzorky
Výstavba knižnice
Sekvenovanie
Analýza dát
Popredajné služby
Tok servisných prác
Tkanivo:
Dizajn experimentu
Doručenie vzorky
Extrakcia RNA
Výstavba knižnice
Sekvenovanie
Analýza dát
Popredajné služby
1.Analýza diferenciálnej expresie - graf sopky
Analýza diferenciálnej expresie môže byť spracovaná na úrovni génov na identifikáciu odlišne exprimovaných génov (DEG) a na úrovni izoforiem na odlišnú identifikáciu
vyjadrené prepisy (DET)
2.Hierarchická klastrová tepelná mapa
3. Identifikácia a klasifikácia alternatívnych spojov
Astalavista môže predpovedať päť typov alternatívnych spájacích udalostí.
4.Alternatívna identifikácia polyadenylačných (APA) udalostí a motív na 50 bp upstream od poly-A
Prípad BMK
Alternatívna identifikácia zostrihu a kvantifikácia na úrovni izoforiem sekvenovaním nanopórov s plnou dĺžkou transkriptómu
Publikovaný:Nature Communications, 2020
Stratégia sekvenovania:
Zoskupenie: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (mutácia K700E);3. Normálne B-bunky
Stratégia sekvenovania: sekvenovanie knižnice MinION 2D, sekvenovanie knižnice PromethION 1D;krátke čítanie údajov z rovnakých vzoriek
Sekvenčná platforma: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;
Kľúčové výsledky
1. Alternatívna identifikácia spájania na úrovni izoforiem
Dlho čítané sekvencie umožňujú identifikáciu mutantu SF3B1K700E- zmenené miesta zostrihu na úrovni izoforiem.Zistilo sa, že 35 alternatívnych 3′SS a 10 alternatívnych 5′SS je medzi SF3B1 výrazne rozdielne zostrihanéK700Ea SF3B1WT.33 z 35 zmien bolo novoobjavených dlho čítanými sekvenciami.
2. Kvantifikácia alternatívneho zostrihu na úrovni izoforiem
Expresia izoforiem retencie intrónov (IR) v SF3B1K700Ea SF3B1WTboli kvantifikované na základe nanopórových sekvencií, čo odhalilo globálnu down-reguláciu IR izoforiem v SF3B1K700E.
Odkaz
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV a kol.Celodĺžková transkriptová charakterizácia mutácie SF3B1 pri chronickej lymfocytovej leukémii odhaľuje downreguláciu zadržaných intrónov[J].Prírodné komunikácie.
