Produkty

Sekvenovanie mRNA plnej dĺžky - PacBio

Sekvenovanie mRNA v plnej dĺžke - PacBio Featured Image

De novosekvenovanie transkriptómu v plnej dĺžke, tiež známe akoDe novoIso-Seq využíva výhody sekvenátora PacBio v dĺžke čítania, ktorý umožňuje sekvenovanie molekúl cDNA plnej dĺžky bez akýchkoľvek prestávok.Tým sa úplne zabráni akýmkoľvek chybám generovaným v krokoch zostavovania prepisu a vytvorí sa unigénne sady s rozlíšením na úrovni izoforiem.Tieto unigénne sady poskytujú výkonnú genetickú informáciu ako „referenčný genóm“ na úrovni transkriptómu.Okrem toho, v kombinácii s údajmi o sekvenovaní ďalšej generácie, táto služba umožňuje presnú kvantifikáciu expresie na úrovni izoforiem.

Platforma: PacBio Sequel II

Knižnica: SMRT zvonková knižnica

Kontaktuj nás

Podrobnosti o službe

Demo výsledky

Prípadová štúdia

Výhody služby

● Priame odčítanie molekuly cDNA s plnou dĺžkou od 3'- konca po 5'- koniec

● Rozlíšenie na úrovni izoformy v štruktúre sekvencie

● Prepisy s vysokou presnosťou a integritou

● Vysoká kompatibilita s rôznymi druhmi

● Veľká kapacita sekvenovania so 4 vybavenými sekvenčnými platformami PacBio Sequel II

● Skúsenosti s viac ako 700 projektmi sekvenovania RNA na báze Pacbio

● Doručovanie výsledkov na báze BMKCloud: Na platforme je k dispozícii prispôsobené dolovanie údajov.

● Popredajné služby platné 3 mesiace po dokončení projektu

Špecifikácie služby

Platforma: PacBio Sequel II

Sekvenačná knižnica: Poly A-obohatená mRNA knižnica

Odporúčaná výťažnosť dát: 20 Gb/vzorka (v závislosti od druhu)

FLNC（%））: ≥75%

*FLNC: Nechimérické prepisy plnej dĺžky

Bioinformatické analýzy

● Spracovanie nespracovaných údajov

● Identifikácia prepisu

● Štruktúra sekvencie

● Kvantifikácia výrazov

● Anotácia funkcie

Vzorové požiadavky a doručenie

Vzorové požiadavky:

Nukleotidy:

Konc. (ng/μl)

množstvo (μg)

Čistota

bezúhonnosť

≥ 120

≥ 0,6

OD260/280 = 1,7-2,5

OD260/230 = 0,5-2,5

Obmedzená alebo žiadna kontaminácia proteínmi alebo DNA na géli.

Pre rastliny: RIN≥7,5;

Pre zvieratá: RIN≥8,0;

5,0≥ 28S/18S≥1,0;

obmedzená alebo žiadna základná elevácia

Tkanivo: Hmotnosť (suché):≥1 g
*Pre tkanivo menšie ako 5 mg odporúčame zaslať bleskovo zmrazenú (v tekutom dusíku) vzorku tkaniva.

Bunková suspenzia:Počet buniek = 3 x 10⁶- 1×10⁷
*Odporúčame zaslať zmrazený bunkový lyzát.V prípade, že počet buniek je menší ako 5×10⁵Odporúča sa rýchle zmrazenie v tekutom dusíku, čo je vhodnejšie na mikroextrakciu.

Vzorky krvi:Objem ≥ 1 ml

Mikroorganizmus:Hmotnosť ≥ 1 g

Odporúčané doručenie vzorky

Nádoba:
2 ml centrifugačná skúmavka (neodporúča sa cínová fólia)
Označenie vzoriek: Skupina+replikácia napr. A1, A2, A3;B1, B2, B3......

Náklad:

1. Suchý ľad: Vzorky je potrebné zabaliť do vrecúšok a zakopať do suchého ľadu.
2. Skúmavky RNAstable: Vzorky RNA možno vysušiť v skúmavke na stabilizáciu RNA (napr. RNAstable®) a odoslať pri izbovej teplote.

Tok servisných prác

Dizajn experimentu

Doručenie vzorky

Extrakcia RNA

Výstavba knižnice

Sekvenovanie

Analýza dát

Popredajné služby

Predchádzajúce: Sekvenovanie eukaryotickej mRNA - Illumina

Ďalšie: Sekvenovanie mRNA s plnou dĺžkou - nanopór

1.distribúcia dĺžky FLNC

Dĺžka nechimérického čítania s plnou dĺžkou (FLNC) označuje dĺžku cDNA v konštrukcii knižnice.Distribúcia dĺžky FLNC je kľúčovým ukazovateľom pri hodnotení kvality konštrukcie knižnice.

mRNA-FLNC-read-length-distribution

Distribúcia dĺžky čítania FLNC

2. Kompletná distribúcia dĺžky oblasti ORF

TransDecoder používame na predpovedanie oblastí kódujúcich proteín a zodpovedajúcich aminokyselinových sekvencií na vytvorenie unigénnych súborov, ktoré obsahujú kompletné neredundantné informácie o transkriptoch vo všetkých vzorkách.

mRNA-Complete-ORF-length-distribution

Kompletná distribúcia dĺžky oblasti ORF

3. Analýza obohatenia dráhy KEGG

Diferenciálne exprimované transkripty (DET) možno identifikovať porovnaním údajov o sekvenovaní RNA na báze NGS na súboroch transkriptov s plnou dĺžkou generovaných údajmi o sekvenovaní PacBio.Tieto DET môžu byť ďalej spracované pre rôzne funkčné analýzy, napr. analýzu obohatenia KEGG dráhy.

mRNA-DEG-KEGG-cesta-obohatenie

Obohatenie dráhy DET KEGG - Bodový graf

Prípad BMK

Vývojová dynamika transkriptómu kmeňa Populus

Publikovaný: Plant Biotechnology Journal, 2019

Stratégia sekvenovania:
Vzorová zbierka:kmeňové oblasti: vrchol, prvé internodium (IN1), druhé internode (IN2), tretie internode (IN3), internode (IN4) a internode (IN5) z Nanlin895
NGS-sekvencia:RNA 15 jedincov sa spojila ako jedna biologická vzorka.Pre NGS sekvenciu boli spracované tri biologické replikáty každého bodu
TGS sekvencia:Kmeňové oblasti boli rozdelené do troch oblastí, tj apex, IN1-IN3 a IN4-IN5.Každá oblasť bola spracovaná na sekvenovanie PacBio so štyrmi typmi knižníc: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb a 3-10 kb.

Kľúčové výsledky

1. Celkovo bolo identifikovaných 87150 transkriptov plnej dĺžky, v ktorých bolo identifikovaných 2081 nových izoforiem a 62058 nových alternatívnych zostrihaných izoforiem.
Identifikovalo sa 2 1187 lncRNA a 356 fúznych génov.
3. Od primárneho rastu po sekundárny rast bolo identifikovaných 15 838 odlišne exprimovaných transkriptov z 995 odlišne exprimovaných génov.Vo všetkých stupňoch bolo 1216 transkripčných faktorov, z ktorých väčšina ešte nebola hlásená.
4. Analýza obohatenia GO odhalila dôležitosť bunkového delenia a oxidačno-redukčného procesu v primárnom a sekundárnom raste.