МЕТАГЕНОМИКА
Полные закрытые бактериальные геномы из микробиомов с использованием секвенирования нанопор
Нанопоровое секвенирование |Метагеномика |МАГ |Циркулизация бактериального генома |Микробиота кишечника
Основные моменты
1. В этом исследовании был представлен новый метод извлечения длинных фрагментов ДНК, который позволил извлечь микрограмм чистой ДНК высокой молекулярной массы, подходящей для секвенирования с длинным считыванием, из 300 мг стула.
2. В этом исследовании был представлен рабочий процесс сборки Lathe, в котором MAG собирались путем длинного чтения и корректировались короткими чтениями.
3. Токарный станок оценивался по пробной смеси.7 из 12 бактерий успешно собрались в одиночные контиги, а 3 — в четыре или менее контигов.
4. Далее токарный станок был применен к образцам стула, в результате чего было получено 20 кольцевых геномов, включая Prevotella copri и кандидата Cibiobacter sp., которые были известны своим богатством мобильных генетических элементов.
Главное достижение
Протокол экстракции ДНК HWM
Давние метагеномные исследования кишечника, основанные на секвенировании, долгое время страдали от трудностей при экстракции высокомолекулярной ДНК (HMW) из стула.В этом исследовании был введен протокол экстракции на основе ферментов, чтобы избежать обширного сдвига путем измельчения шариков традиционными методами.Как показано на следующем рисунке, образцы сначала обрабатывали коктейлем ферментов, включая литический фермент, MetaPolyzyme и т. д., для разрушения клеточных стенок.Высвободившуюся ДНК экстрагировали с помощью системы фенол-хлороформ с последующим расщеплением протеиназой К и РНКазой А, очисткой на колонке и выбором размера SPRI.Этот метод позволил получить микрограммы ДНК HMW из 300 м кала, что соответствует требованиям долгосрочного секвенирования как с точки зрения качества, так и количества.
Рисунок 1. Схема выделения ДНК HWM
Схема работы токарного станка
Как показано на следующем рисунке, Lathe содержит существующий процесс необработанного базового вызова с использованием Guppy.Затем Флай и Кану по отдельности создают две длинные сборки с последующим обнаружением и удалением неправильной сборки.Два узла сборки объединяются с помощью быстрого слияния.После слияния большие сборки на уровне мегабазы проверяются на цикличность.Впоследствии согласованное уточнение этих сборок обрабатывается с помощью коротких чтений.Окончательно собранные бактериальные геномы обрабатываются для окончательного обнаружения и удаления неправильной сборки.
Рис. 2. Схема сборки токарного станка.
Оценка токарного станка с имитацией смеси бактерий
Стандартную смесь 12 видов ATCC, включающую как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии, использовали для оценки эффективности платформы для секвенирования нанопор и токарного станка в сборке MAG.Всего 30,3 Гб данных было сгенерировано платформой нанопор с N50 5,9 кб.Токарный станок значительно улучшил сборку N50 в 1,6–4 раза по сравнению с другими сборочными инструментами длительного чтения и в 2–9 раз по сравнению с гибридными сборочными инструментами.Из 12 геномов бактерий семь были собраны в отдельные контиги (рис. 3. Цирки с черной точкой).Еще три были собраны в четыре или меньше контигов, причем наиболее неполная сборка содержала 83% генома в одном контиге.
Рисунок 3. Геномные сборки в определенной бактериальной смеси из 12 видов.
Применение токарного станка в образцах стула
Этот метод был дополнительно применен к образцам человеческого стула, чтобы сравнить идентификацию организма и смежность сборки с существующими методами, анализом на основе облака считывания и анализа на основе короткого считывания.Из трех задействованных образцов новая экстракция на основе ферментов дала по меньшей мере 1 мкг на 300 мг входной массы.Секвенирование нанопор этой ДНК HMW привело к получению длинных ридов с N50 4,7 КБ, 3,0 КБ и 3,0 КБ соответственно.Примечательно, что настоящий метод показал большой потенциал в обнаружении микробов по сравнению с существующими методами.Здесь было показано относительно более высокое альфа-разнообразие на видовом уровне по сравнению с коротким чтением и облаком чтения.Более того, этим методом были выделены все роды из короткого анализа, даже обычно устойчивые к лизису грамположительные организмы.
Рисунок 4. Альфа-разнообразие и таксономические компоненты, определенные методами Nanopore, Short-read и Read-cloud.
Токарный станок позволил получить гораздо более длинную целую сборку N50, чем сборку короткого чтения или сборки облака чтения, несмотря на в три-шесть раз меньший ввод необработанных данных.Черновики геномов были получены путем объединения контигов, при котором черновики классифицировались на «высококачественные» или «частичные» на основании полноты, загрязнения, единичных копий основных генов и т. д. Сборка длительного считывания показала гораздо более высокую смежность при меньших затратах по сравнению с для короткого чтения и чтения облака.
Рисунок 5. Непрерывность сборки каждого организма для каждого метода.
Более того, нынешний подход к сборке способен создавать закрытые кольцевые геномы.В образцах стула было собрано восемь высококачественных одноконтиговых геномов, пять из которых достигли четкой циркуляризации.Долгожданный подход также продемонстрировал впечатляющую способность распознавать повторяющиеся элементы в геномах.РаспространенныйП. копригеном был создан с помощью этого подхода, который, как известно, содержит высокую степень повторения последовательностей.Лучшая сборка этого генома при коротком чтении и чтении в облаке никогда не превышала N50 в 130 КБ даже при глубине покрытия 4800X.Эти элементы с большим количеством копий были полностью решены с помощью подхода длительного чтения, который часто встречается в критических точках сборок короткого чтения или чтения в облаке.В этом исследовании сообщалось о другом закрытом геноме, который, как полагают, является членом недавно описанногоЦибиобактерклада.В этой закрытой сборке было идентифицировано пять предполагаемых фагов размером от 8,5 до 65,9 т.п.н.
Рисунок 6. Циркос-диаграмма закрытых геномов P.copri и Cibiobacter sp.
Ссылка
Мосс, Э.Л., Магини, Д.Г., и Бхатт, А.С. (2020).Полные закрытые бактериальные геномы из микробиомов с использованием секвенирования нанопор.Природная биотехнология,38(6), 701-707.
Технологии и основные моменты Целью является обмен последними успешными применениями различных технологий высокопроизводительного секвенирования в различных областях исследований, а также блестящими идеями в области экспериментального проектирования и интеллектуального анализа данных.
Время публикации: 7 января 2022 г.