ГЕНОМИКА ЧЕЛОВЕКА
природа генетика
Секвенирование длинного считывания идентифицирует расширение повторов GGC в NOTCH2NLC, связанное с болезнью нейрональных внутриядерных включений.
Ресеквенирование ONT |Иллюмина |Секвенирование всего экзома |Целевое секвенирование CRISPR-Cas9 ONT |РНК-секвенирование |Вызов метилирования ONT 5mC
Основные моменты
1. Путем анализа сцепления в большом семействе НИИД были идентифицированы два связанных региона.
2. Секвенирование длинного считывания на основе ONT и обогащение, опосредованное Cas-9. Секвенирование ONT выявило потенциальную генетическую причину NIID, экспансию повторов GGC в 5'-UTR NOTCH2NLC.В этом исследовании впервые сообщалось об увеличении повторов в генах, специфичных для человека, которые развились посредством сегментных дупликаций.
3. Секвенирование РНК выявило аномальные антисмысловые транскрипты в начале или внутри областей расширения повторов GGC в NOTCH2NLC.
Фон
Nневральная внутриядерная болезнь включений (НИИБ) — прогрессирующее и фатальное нейродегенеративное заболевание, характеризующееся наличием эозинофильных гиалиновых внутриядерных включений в центральной и периферической нервной системе.Его весьма вариабельные клинические проявления создают большие трудности в диагностике вплоть до проведения биопсии кожи.Однако методы, основанные на гистопатологии, по-прежнему страдают от ошибочных диагнозов, что требует генетического понимания НИИД.
Достижения
Анализ связей
SСеквенирование с коротким чтением на основе полногеномного секвенирования (WGS) и полноэкзомного секвенирования (WES) было выполнено в большой семье NIID (13 пораженных и 7 незатронутых членов).Анализ сцепления SNP, извлеченных из этих данных, выявил только две связанные области: область размером 3,5 МБ в 1p36.31-p36.22 (максимальный уровень детализации = 2,32) и область 58,1 МБ в 1p22.1-q21.3 (максимальный уровень детализации: 4,21). ).Однако в этих связанных регионах не было выявлено никаких патогенных SNP или CNV.
Расширения повторов GGC в NOTCH2NLC
NСеквенирование на основе анопор было обработано на 13 пораженных и 4 незатронутых членах из 8 семей (еще один пораженный член был секвенирован с помощью платформы секвенирования длинного чтения Pacbio).Давно прочитанные данные выявили связанное с заболеванием расширение повторов GGC в 5'-UTR гена NOTCH2NLC, картированное в связанной области размером 58,1 Мб (рис. 1).Эти расширения повторов также были выявлены во всех 40 спорадических случаях НИИД, проверенных с помощью RP-PCR.
Cas-9-опосредованное целевое секвенирование на платформе нанопор было использовано для достижения более высокого охвата считывания повтора NOTCH2NLC (100 X-1795 X).Эти консенсусные последовательности хорошо согласуются с предыдущими данными об экспансии повторов GGC.Более того, повторы {(GGA)n (GGC)n}n были идентифицированы как потенциальный генетический маркер фенотипа с доминированием слабости (рис. 2).
Рисунок 1. Связанное с заболеванием расширение повторов, выявленное в экзоне 1 изоформ NOTCH2NLC.
Рисунок 2. Консенсусные последовательности повтора NPTCH2NLC у пациентов NIID с (*) или без фенотипа с доминированием слабости.
NГены OTCH2NL — это гены, специфичные для человека, которые, как полагают, играют жизненно важную роль в эволюции человеческого мозга и неврологических заболеваниях.Однако три родственных гена NOTCH2 (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB и NOTCH2NLC) с идентичностью последовательностей >99,1% не были определены до последней сборки генома человека.Секвенирование без синтеза и секвенирование с длинным считыванием на платформе нанопор показало заметные преимущества в разрешении областей высокого сходства и повторов (GGC)n со 100%-ным содержанием GC.
Расширения повторов GGC в NOTCH2NLC
TСеквенирование ранскриптома было обработано у 2 пораженных и 2 незатронутых членов.Нормализованную глубину считывания рассчитывали для смысловых и антисмысловых цепей выше первых экзонов паралогов NOTCH2NL.Аномальные антисмысловые транскрипты были обнаружены только в пораженных случаях, которые расположены в начале или внутри области расширения повтора (фиолетовые пики в F1-14 и F1-16 на рисунке 3).Кроме того, было идентифицировано 54 DEG, и все они были обогащены терминами GO и MPO, связанными с функциями нейронов.
Рисунок 3. Нормализованная глубина считывания выше первого экзона NOTCH2NLC в непораженных (вверху) и пораженных (внизу) случаях.
Технологии
Оксфордские нанопоровые технологии (ONT)
NСеквенирование анопор отличается от других платформ секвенирования тем, что нуклеотиды считываются напрямую, без процесса синтеза ДНК.Когда одноцепочечная ДНК проходит через белковую пору наноразмера (нанопору), разные нуклеотиды генерируют разные ионные токи, которые можно захватывать и передавать в последовательность оснований.Сама платформа секвенирования ONT не имеет очевидных технических ограничений на длину считывания ДНК.Таким образом, сверхдлинные чтения (ULR) доступны для сборки генома высокого качества.Более того, эти чрезвычайно длинные чтения, которые достаточно длинны, чтобы пересечь сложные особенности последовательности или структурные вариации, помогают здесь преодолеть ограничения секвенирования с коротким чтением.
Нанопоровое секвенирование
Идентификация структурных изменений (SV)
SСеквенирование без синтеза в значительной степени сохраняет информацию о метилировании ДНК на матрице.Метилированные A, T, C и G генерируют ионные токи, отличные от неметилированных, которые могут быть считаны непосредственно платформой.Секвенирование нанопор позволяет проводить полногеномное профилирование как 5mC, так и 6mA с разрешением в один нуклеотид.
Ссылка
Джун Соне и др.ал.Секвенирование длинного считывания идентифицирует расширение повторов GGC в NOTCH2NLC, связанное с болезнью внутриядерных включений нейронов.Природная генетика (2019)
Технологии и основные моменты Целью является обмен последними успешными применениями различных технологий высокопроизводительного секвенирования в различных областях исследований, а также блестящими идеями в области экспериментального проектирования и интеллектуального анализа данных.
Время публикации: 06 января 2022 г.