ТРАНСКРИПТОМИКА
природа
КОММУНИКАЦИИ
Полноразмерная характеристика транскрипта мутации SF3B1 при хроническом лимфоцитарном лейкозе выявила подавление сохраненных интронов
Полные стенограммы|Нанопоровое секвенирование|Альтернативный анализ изоформ
Фон
SШироко сообщалось, что оматические мутации в факторе сплайсинга SF3B1 связаны с различными видами рака, включая хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), увеальную меланому, рак молочной железы и т. д. Кроме того, краткие транскриптомные исследования выявили аберрантные паттерны сплайсинга, индуцированные мутациями SF3B1.Однако исследования этих альтернативных паттернов сплайсинга долгое время ограничивались уровнем событий и отсутствием знаний об уровне изоформ из-за ограничения коротких считываемых собранных транскриптов.Здесь была представлена платформа секвенирования нанопор для генерации полноразмерных транскриптов, что позволило изучить изоформы AS.
Экспериментальная дизайн
Эксперименты
Группировка:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1 (мутация K700E);3. Нормальные B-клетки
Стратегия секвенирования:Секвенирование библиотеки MinION 2D, секвенирование библиотеки PromethION 1D;данные короткого чтения из одних и тех же образцов
Платформа секвенирования:ОНТ МинИОН;ОНТ ПрометИОН;
Биоинформатический анализ
Полученные результаты
АВсего было получено 257 миллионов прочтений из 6 образцов ХЛЛ и 3 В-клеток.В среднем 30,5% этих прочтений были идентифицированы как полноразмерные транскрипты.
FПолноразмерный альтернативный анализ изоформ РНК (FLAIR) был разработан для получения набора изоформ с высокой достоверностью.FLAIR можно резюмировать следующим образом:
Nвыравнивание считываний anopore: определение общей структуры транскрипта на основе эталонного генома;
Sкоррекция сплайс-соединения: исправление ошибок последовательности (красный) с сайтом сплайсинга либо из аннотированных интронов, либо из интронов из данных короткого считывания, либо из того и другого;
Cсвернуть: суммировать репрезентативные изоформы на основе цепей сплайсинга (набор первого прохождения).Выберите ISO с высокой степенью достоверности на основе количества поддерживающих операций чтения (порог: 3).
Рисунок 1. Анализ FLAIR для выявления полноразмерных изоформ, связанных с мутацией SF3B1 при ХЛЛ.
FLAIR идентифицировал 326 699 сплайсированных изоформ с высокой степенью достоверности, 90% из которых являются новыми изоформами.Было обнаружено, что большинство из этих неаннотированных изоформ представляют собой новые комбинации известных сплайсинговых соединений (142 971), тогда как остальные новые изоформы содержат либо сохраненный интрон (21 700), либо новый экзон (3594).
LПоследовательности ong-read позволяют идентифицировать мутантные SF3B1-K700E-измененные сайты сплайсинга на уровне изоформы.Было обнаружено, что 35 альтернативных 3'SS и 10 альтернативных 5'SS подвергаются значительно дифференциальному сплайсингу между SF3B1-K700E и SF3B1-WT.33 из 35 изменений были недавно обнаружены при длительном чтении последовательностей.В данных Nanopore распределение расстояний между SF3B1-K700E-измененными 3'SS до пиков канонических сайтов составляет около -20 п.о., что значительно отличается от контрольного распределения, аналогично тому, что сообщалось в последовательностях короткого чтения CLL.Были проанализированы изоформы гена ERGIC3, где новая изоформа, содержащая проксимальный сайт сплайсинга, была обнаружена в большем количестве в SF3B1-K700E.Как проксимальные, так и дистальные 3'SS были связаны с различными паттернами AS, генерирующими множество изоформ.
Рисунок 2. Альтернативные паттерны 3'-сплайсинга, выявленные с помощью данных секвенирования нанопор.
Анализ использования событий IR долгое время был ограничен анализом на основе краткого чтения из-за уверенности в идентификации и количественной оценке IR.Экспрессия изоформ IR в SF3B1-K700E и SF3B1-WT была количественно оценена на основе последовательностей нанопор, что выявило глобальное подавление изоформ IR в SF3B1-K700E.
Рисунок 4. Интенсивность сельского хозяйства и сетевая связь между тремя сельскохозяйственными системами (A и B);Случайный анализ леса (C) и связь между интенсивностью сельского хозяйства и колонизацией AMF (D)
Рисунок 3. События удержания интронов более сильно подавляются у CLL SF3B1-K700E.
Технологии
Нанопоровое секвенирование длинного считывания
NСеквенирование анопоров — это технология секвенирования электрического сигнала одной молекулы в реальном времени.
Dдвухцепочечная ДНК или РНК будет связываться с нанопористым белком, встроенным в биопленку и раскручивающимся под руководством моторного белка.
DНити NA/РНК проходят через белок канала нанопор с определенной скоростью под действием разности потенциалов.
Mолекулы генерируют различные электрические сигналы в зависимости от химической структуры.
RОбнаружение последовательностей в режиме реального времени достигается путем вызова оснований.
Выполнение полноразмерного секвенирования транскриптома
√ Насыщение данными
Для достижения сопоставимой насыщенности данными требуется в 7 раз меньше операций чтения.
√ Идентификация структуры транскрипта
Идентификация разнообразных структурных вариантов с согласованным полноразмерным считыванием каждого транскрипта.
√ Дифференциальный анализ на уровне стенограммы. Выявляйте изменения, скрытые в коротких чтениях.
Ссылка
Тан А.Д., Сулетт К.М., Барен М.Дж.В. и др.Полноразмерная характеристика транскрипта мутации SF3B1 при хроническом лимфоцитарном лейкозе выявила подавление сохраненных интронов [J].Природные коммуникации.
Технологии и основные моменты Целью является обмен последними успешными применениями различных технологий высокопроизводительного секвенирования в различных областях исследований, а также блестящими идеями в области экспериментального проектирования и интеллектуального анализа данных.
Время публикации: 08 января 2022 г.