ПОЛНОГЕНОМНОЕ РЕСЕКВЕНИРОВАНИЕ
Геномный мониторинг SARS-CoV-2 выявил вариант делеции Nsp1, который модулирует реакцию интерферона I типа.
Нанопор |Иллюмина |Полногеномное ресеквенирование |метагеномика |РНК-секвенирование |Сэнгер
Biomarker Technologies предоставила техническую поддержку по секвенированию образцов в этом исследовании.
Основные моменты
1. Секвенирование генома SARS-CoV-2 и филогенетический анализ выявили 35 повторяющихся мутаций, включая 31 SNP и 4 Indel.
2.Ассоциация со 117 клиническими фенотипами потенциально раскрывает
важные мутации.
∆500–532 в кодирующей области Nsp1 коррелирует с более низким вирусным
3.нагрузка и сывороточный IFN-β.
4. Вирусные изоляты с мутацией ∆500-532 вызывают снижение уровня IFN-I.
ответ в инфицированных клетках.
Экспериментальная дизайн
Достижения
1. Эпидемиологический и геномный надзор за COVID-19.
Клинические данные были собраны в провинции Сычуань, Китай, за период вспышки с 22 января 2020 г. по 20 февраля 2020 г. В общей сложности 538 случаев COVID-19 были подтверждены с помощью qPCR-тестов в Сычуани, 28,8% из которых были из провинции. капитал.Число подтвержденных случаев в Сычуани росло в геометрической прогрессии, достигнув пика 30 января.Кроме того, данные подтверждают, что социальное дистанцирование может быть ключевым фактором в предотвращении распространения вируса.
Рисунок 1. Эпидемиологическое исследование COVID-19 в провинции Сычуань, Китай.
2. Конструирование генома SARS-CoV-2 и идентификация вариантов
С помощью мультиплексной ПЦР-амплификации с последующим секвенированием нанопор было получено в общей сложности 310 почти или частично полных геномов от 248 пациентов с ок.80% геномов охвачены 10 чтениями (средняя глубина: 0,39 млн чтений на образец).
Рисунок 2. Частота каждого варианта в когорте Сычуани
Всего из геномов SARS-CoV-2 было идентифицировано 104 SNP и 18 Indel, в которых 31 SNP и 4 Indel были идентифицированы как рекуррентные генетические варианты.Сравнивая их со 169 образцами из Ухани и с 81 391 высококачественной публичной последовательностью генома в GISAID, 29 из 35 обнаруженных вариантов представлены на других континентах.Примечательно, что четыре варианта, включая ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 и T13243C, присутствовали только в Сычуани и Ухане и отсутствовали в данных GISAID, что указывает на то, что эти варианты, скорее всего, были заимствованы из Ухани, что соответствует путевые листы пациентов.
Эволюционный анализ с использованием метода максимального правдоподобия (ML) и подходов байесовских молекулярных часов был обработан на 88 новых вирусах из провинции Сычуань и 250 курируемых геномах из других регионов.Геномы с ∆500–532 (делеции в кодирующей области Nsp1) были обнаружены редко распределенными на филогенетическом дереве.Анализ гаплотипов вариантов Nsp1 выявил 5 из них из разных городов.Эти результаты показали, что вирус ∆500-532 встречается во многих городах и может быть завезен несколько раз из Ухани.
Рисунок 2. Рекуррентные генетические варианты и филогенетический анализ в геномах SARS-CoV-2.
3. Ассоциация рецидивирующих генетических вариантов с клиническими последствиями.
117 клинических фенотипов были связаны с тяжестью заболевания COVID-19, при этом 19 связанных с тяжестью фенотипов были классифицированы на тяжелые и нетяжелые признаки.Связь между этими признаками и 35 повторяющимися генетическими вариантами была визуализирована на бикластерной тепловой карте.Анализ ранжированного обогащения, подобный GSEA, показал, что ∆500-532 отрицательно коррелирует с СОЭ, сывороточным IFN-β и количеством CD3+CD8+ Т-клеток в крови.Более того, тесты qPCR показали, что пациенты, инфицированные вирусом, содержащим ∆500-532, имели самое высокое значение Ct, то есть самую низкую вирусную нагрузку.
Рисунок 3. Ассоциации 35 рекуррентных генетических вариантов с клиническими фенотипами.
4. Валидация клинических фенотипов, связанных с вирусными мутациями.
Чтобы понять влияние ∆500-532 на функции Nsp1, клетки HEK239T трансфицировали плазмидами, экспрессирующими полноразмерные, WT Nsp1 и мутантные формы с делециями.Профили транскриптома каждой обработанной клетки HEK239T были обработаны для анализа PCA, который показал, что делеционные мутанты кластеризовались относительно ближе и значительно отличались от WT Nsp1.Гены, активность которых была значительно повышена у мутантов, в основном были обогащены «процессом биосинтеза/метаболизма пептидов», «биогенезом рибонуклеопротеинового комплекса», «нацеливанием белка на мембрану/ЭР» и т. д. Более того, две делеции показали отчетливый паттерн экспрессии из WT.
Рисунок 4. Анализ транскриптома клеток HEK239T, трансфицированных WT Nsp1, и клеток с делециями.
Влияние делеций на реакцию IFN-1 также было проверено в исследовании сверхэкспрессии.Было показано, что все протестированные делеции снижают реакцию IFN-1 в трансфицированных клетках HEK239T и A549 как на уровне транскриптома, так и на уровне белка.Интересно, что гены с существенно сниженной регуляцией в делециях были обогащены «защитным ответом на вирус», «репликацией вирусного генома», «регуляцией транскрипции с помощью РНК-полимеразы II» и «реакцией на интерферон I типа».
Рисунок 5. Понижающая регуляция сигнальных путей интерферона у мутанта ∆500-532.
В этом исследовании влияние этих делеций на вирус было дополнительно подтверждено исследованиями вирусных инфекций.Вирусы с определенными мутантами были выделены из клинических образцов и заражены клетками Calu-3.Подробные результаты изучения вирусных инфекций можно прочитать в статье.
дои:10.1016/ж.чом.2021.01.015
Ссылка
Линь Дж., Тан С., Вэй Х. и др.Геномный мониторинг SARS-CoV-2 обнаруживает вариант делеции Nsp1, который модулирует реакцию интерферона I типа[J].Клетка-хозяин и микроб, 2021 год.
Новости и основные моменты цель – поделиться последними успешными случаями с Biomarker Technologies, фиксируя новые научные достижения, а также выдающиеся методы, примененные в ходе исследования.
Время публикации: 06 января 2022 г.