Продукты

Полноразмерное секвенирование мРНК – нанопора

Полноразмерное секвенирование мРНК – нанопоры Рекомендуемое изображение

Секвенирование РНК стало бесценным инструментом для комплексного анализа транскриптома.Несомненно, традиционное секвенирование короткого считывания достигло здесь многочисленных важных успехов.Тем не менее, он часто сталкивается с ограничениями при полноразмерной идентификации изоформ, количественном определении и систематической ошибке ПЦР.

Секвенирование нанопор отличается от других платформ секвенирования тем, что нуклеотиды считываются напрямую, без синтеза ДНК, и генерирует длинные чтения в десятках килобаз.Это дает возможность прямого считывания, пересечения полноразмерных транскриптов и решения проблем в исследованиях на уровне изоформ.

Платформа:Нанопор ПрометИОН

Библиотека:кДНК-ПЦР

Связаться с нами

Детали услуги

Демонстрационные результаты

Тематическое исследование

Преимущества сервиса

● Низкое смещение последовательности

● Выявление полноразмерных молекул кДНК.

● Для покрытия того же количества стенограмм требуется меньше данных.

● Идентификация нескольких изоформ одного гена.

● Количественная оценка экспрессии на уровне изоформ.

Технические характеристики услуги

Библиотека

Платформа

Рекомендуемый объем данных (ГБ)

Контроль качества

кДНК-ПЦР (обогащенная поли-А)

Нанопор ПрометИОН P48

6 Гб/выборка (в зависимости от вида)

Соотношение полной длины>70%

Средний балл качества: Q10

Биоинформатический анализ

●Обработка необработанных данных

● Идентификация стенограммы

● Альтернативный сплайсинг

● Количественная оценка экспрессии на уровне генов и изоформ.

● Анализ дифференциальных выражений.

● Аннотация и расширение функций (DEG и DET).

Требования к образцам и доставка

Образец требований:

Нуклеотиды:

Конц.(нг/мкл)

Количество (мкг)

Чистота

Честность

≥ 100

≥ 0,6

ОД260/280=1,7-2,5

ОД260/230=0,5-2,5

Ограниченное или полное отсутствие загрязнения белками или ДНК на геле.

Для растений: RIN≥7,0;

Для животных: РИН≥7,5;

5,0≥28S/18S≥1,0;

ограниченное или отсутствующее повышение базовой линии

Ткань: Вес (сухой): ≥1 г

*Для тканей весом менее 5 мг мы рекомендуем отправлять быстрозамороженные (в жидком азоте) образцы тканей.

Клеточная суспензия: количество клеток = 3×10.⁶- 1×10⁷

*Мы рекомендуем отправлять замороженный лизат клеток.Если количество ячеек меньше 5 × 10⁵рекомендуется мгновенное замораживание в жидком азоте, что предпочтительнее для микроэкстракции.

Образцы крови: Объем ≥1 мл.

Рекомендуемая доставка образцов

Контейнер: центрифужная пробирка объемом 2 мл (не рекомендуется использовать фольгу).

Маркировка образца: Группа + повтор, например, А1, А2, А3;Б1, Б2, Б3... ...

Отгрузка: 2. Сухой лед: образцы необходимо упаковать в мешки и закопать в сухой лед.

Пробирки RNAstable: образцы РНК можно сушить в пробирках для стабилизации РНК (например, RNAstable®) и транспортировать при комнатной температуре.

Рабочий процесс обслуживания

Нуклеотиды:

Доставка образца

Строительство библиотеки

Последовательность действий

Анализ данных

Послепродажное обслуживание

Рабочий процесс обслуживания

Салфетка:

Дизайн эксперимента

Доставка образца

экстракция РНК

Строительство библиотеки

Последовательность действий

Анализ данных

Послепродажное обслуживание

Предыдущий: Полноразмерное секвенирование мРНК - PacBio

Следующий: 10 пространственных транскриптомов Genomics Visium

1.Анализ дифференциальной экспрессии - график вулкана

Анализ дифференциальной экспрессии может проводиться как на уровне генов для идентификации дифференциально экспрессируемых генов (DEG), так и на уровне изоформ для дифференциальной идентификации.

3(1)

экспрессированные транскрипты (DET)

2.Тепловая карта иерархической кластеризации

3. Альтернативная идентификация и классификация сплайсинга.

Astalavista может предсказать пять типов альтернативных событий сплайсинга.

4.Идентификация событий альтернативного полиаденилирования (APA) и мотива на 50 п.о. выше поли-А

Дело БМК

Идентификация альтернативного сплайсинга и количественная оценка уровня изоформ путем полноразмерного секвенирования транскриптома нанопор

Опубликовано:Природные коммуникации, 2020

Стратегия секвенирования:

Группировка: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (мутация K700E);3. Нормальные B-клетки

Стратегия секвенирования: секвенирование библиотеки MinION 2D, секвенирование библиотеки PromethION 1D;данные короткого чтения из одних и тех же образцов

Платформа для секвенирования: Nanopore MinION;Нанопор ПрометИОН;

Ключевые результаты

1. Идентификация альтернативного сплайсинга на уровне изоформы

Длинночтенные последовательности позволяют идентифицировать мутант SF3B1^К700Э-измененные сайты сплайсинга на уровне изоформы.Было обнаружено, что 35 альтернативных 3'SS и 10 альтернативных 5'SS подвергаются значительно дифференциальному сплайсингу между SF3B1.^К700Эи SF3B1^WT.33 из 35 изменений были недавно обнаружены при длительном чтении последовательностей.

2. Количественная оценка альтернативного сплайсинга на уровне изоформ.

Экспрессия изоформ удержания интрона (IR) в SF3B1^К700Эи SF3B1^WTбыли количественно определены на основе последовательностей нанопор, что выявило глобальное подавление изоформ IR в SF3B1.^К700Э.

Ссылка

Тан А.Д., Сулетт К.М., Барен М.Дж.В. и др.Полноразмерная характеристика транскрипта мутации SF3B1 при хроническом лимфоцитарном лейкозе выявила подавление сохраненных интронов [J].Природные коммуникации.