Полноразмерное секвенирование мРНК - PacBio
Преимущества сервиса
● Прямое считывание полноразмерной молекулы кДНК от 3'-конца до 5'-конца.
● Разрешение уровня изоформы в структуре последовательности.
● Стенограммы с высокой точностью и целостностью.
● Высокая совместимость с другими видами.
● Большие возможности секвенирования благодаря 4 оборудованным платформам секвенирования PacBio Sequel II.
● Имеет большой опыт реализации более чем 700 проектов по секвенированию РНК на основе Pacbio.
● Доставка результатов на основе BMKCloud: на платформе доступен индивидуальный анализ данных.
● Послепродажное обслуживание действительно в течение 3 месяцев после завершения проекта.
Технические характеристики услуги
Платформа: PacBio, продолжение II.
Библиотека секвенирования: Библиотека мРНК, обогащенная поли А.
Рекомендуемый объем данных: 20 Гб/выборка (в зависимости от вида)
ФЛНК（%）: ≥75%
*FLNC: Полноразмерные нехимерные трансципты.
Биоинформатический анализ
● Обработка необработанных данных.
● Идентификация стенограммы
● Структура последовательности
● Количественная оценка экспрессии
● Аннотация функции
Требования к образцам и доставка
Образец требований:
Нуклеотиды:
| Конц.(нг/мкл) | Количество (мкг) | Чистота | Честность |
| ≥ 120 | ≥ 0,6 | ОД260/280=1,7-2,5 ОД260/230=0,5-2,5 Ограниченное или полное отсутствие загрязнения белками или ДНК на геле. | Для растений: RIN≥7,5; Для животных: РИН≥8,0; 5,0≥28S/18S≥1,0; ограниченное или отсутствующее повышение базовой линии |
Ткань: Вес (сухой):≥1 г
*Для тканей весом менее 5 мг мы рекомендуем отправлять быстрозамороженные (в жидком азоте) образцы тканей.
Клеточная суспензия:Количество ячеек = 3×106- 1×107
*Мы рекомендуем отправлять замороженный лизат клеток.Если количество ячеек меньше 5 × 105рекомендуется мгновенное замораживание в жидком азоте, что предпочтительнее для микроэкстракции.
Образцы крови:Объем≥1 мл
Микроорганизм:Масса ≥ 1 г
Рекомендуемая доставка образцов
Контейнер:
Центрифужная пробирка объемом 2 мл (не рекомендуется использовать оловянную фольгу)
Маркировка образца: Группа + повтор, например, А1, А2, А3;Б1, Б2, Б3... ...
Отгрузка:
1. Сухой лед: Пробы необходимо упаковать в мешки и закопать в сухой лед.
2. Пробирки RNAstable: образцы РНК можно сушить в пробирках для стабилизации РНК (например, RNAstable®) и транспортировать при комнатной температуре.
Рабочий процесс обслуживания
Дизайн эксперимента
Доставка образца
экстракция РНК
Строительство библиотеки
Последовательность действий
Анализ данных
Послепродажное обслуживание
1. Распределение длины FLNC
Длина полноразмерного нехимерного считывания (FLNC) указывает длину кДНК в конструкции библиотеки.Распределение длины ФЛНК является важным показателем при оценке качества строительства библиотеки.
Распределение длины чтения FLNC
2. Полное распределение длины региона ORF.
Мы используем TransDecoder для прогнозирования кодирующих областей белка и соответствующих аминокислотных последовательностей для создания наборов унигенов, которые содержат полную неизбыточную информацию о транскриптах во всех образцах.
Полное распределение длины региона ORF
3. Анализ обогащения пути KEGG
Дифференциально экспрессируемые транскрипты (DET) можно идентифицировать путем сопоставления данных секвенирования РНК на основе NGS с полноразмерными наборами транскриптов, созданными с помощью данных секвенирования PacBio.Эти DET могут быть дополнительно обработаны для различного функционального анализа, например, анализа обогащения пути KEGG.
Обогащение пути DET KEGG - точечный график
Дело БМК
Динамика развития транскриптома стебля Populus
Опубликовано: Журнал биотехнологии растений, 2019
Стратегия секвенирования:
Сбор образцов:области стебля: вершина, первое междоузлие (IN1), второе междоузлие (IN2), третье междоузлие (IN3), междоузлие (IN4) и междоузлие (IN5) от Nanlin895.
NGS-последовательность:РНК 15 особей были объединены в один биологический образец.Три биологических повтора каждой точки были обработаны для определения последовательности NGS.
TGS-последовательность:Области ствола были разделены на три региона, т.е. вершину, IN1-IN3 и IN4-IN5.Каждый регион обрабатывали для секвенирования PacBio с использованием четырех типов библиотек: 0–1 КБ, 1–2 КБ, 2–3 КБ и 3–10 КБ.
Ключевые результаты
1. Всего было идентифицировано 87150 полноразмерных транскриптов, в которых была идентифицирована 2081 новая изоформа и 62058 новых альтернативных сплайсированных изоформ.
Идентифицировано 21187 днРНК и 356 гибридных генов.
3. От первичного роста до вторичного роста было идентифицировано 15838 дифференциально экспрессируемых транскриптов из 995 дифференциально экспрессируемых генов.Во всех DEG 1216 были факторами транскрипции, о большинстве из которых еще не сообщалось.
4. Анализ обогащения GO выявил важность клеточного деления и окислительно-восстановительного процесса в первичном и вторичном росте.
Альтернативные события сплайсинга и различные изоформы
Анализ WGCNA на факторы транскрипции
Ссылка
Чао Ц, Гао ЗФ, Чжан Д и др.Динамика развития транскриптома стебля Populus.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958
