METAGENOMIA
Genoame bacteriene complete și închise din microbiom folosind secvențierea nanoporilor
Secvențierea nanoporilor |Metagenomica |MAG-uri |Circularizarea genomului bacterian |Microbiota intestinală
Repere
1. O metodă nouă de extragere a fragmentelor lungi de ADN a fost prezentată în acest studiu, care a realizat extragerea de micrograme de ADN HMW pur, potrivite pentru secvențierea de citire lungă din 300 mg de scaun
2. Un flux de lucru de asamblare, Lathe, a fost introdus în acest studiu, în care MAG-urile au fost asamblate prin citiri lungi și corectate prin citiri scurte.
3. Strungul a fost evaluat prin amestec simulat.7 din 12 bacterii au fost asamblate cu succes în conturi unice și 3 au fost asamblate în patru sau mai puține conturi.
4. Strungul a fost aplicat în continuare pe probe de scaun, care au generat 20 de genomi circularizați, inclusiv Prevotella copri și candidatul Cibiobacter sp., care erau cunoscute pentru că sunt bogate în elemente genetice mobile.
Principala realizare
Protocol de extracție pentru ADN HWM
Studiile metagenomice intestinale bazate pe secvențierea cu citire lungă au suferit mult timp din cauza durității extragerii ADN-ului cu greutate moleculară mare (HMW) din scaun.În acest studiu, a fost introdus un protocol de extracție pe bază de enzime pentru a evita forfecarea extinsă prin baterea mărgelelor în metodele tradiționale.După cum se arată în figura următoare, probele au fost tratate mai întâi cu un cocktail de enzime, inclusiv enzime litice, MetaPolyzyme, etc. pentru a degrada pereții celulari.ADN-ul eliberat a fost extras prin sistemul fenol-cloroform, urmat de digestia cu Proteinaza K și RNază A, purificarea pe coloană și selectarea dimensiunii SPRI.Această metodă a reușit să producă micrograme de ADN HMW din 300 m de scaun, care îndeplinește cerințele de secvențiere de citire lungă atât în ceea ce privește calitatea, cât și cantitatea.
Figura 1. Schema de extracție a ADN-ului HWM
Schema fluxului de strung
După cum este descris în figura următoare, Lathe conține procesul existent de proces de apelare de bază brută folosind Guppy.Două ansambluri cu citire lungă sunt apoi produse de Flye și Canu separat, urmate de detectarea și îndepărtarea asamblarii greșite.Cele două sub-ansambluri sunt îmbinate cu quickmerge.La fuziune, ansamblurile mari la nivel de megabază sunt apoi verificate pentru circularizare.Ulterior, rafinarea consensului asupra acestor ansambluri este procesată cu citiri scurte.Genomii bacterieni asamblați finali sunt procesați pentru detectarea și îndepărtarea finală a asamblarii greșite.
Figura 2. Schema fluxului ansamblului strungului
Evaluarea strungului cu amestec de bacterii simulate
Un amestec standard de 12 specii ATCC care cuprinde atât bacterii Gram-pozitive, cât și Gram-negative a fost folosit pentru a evalua performanța platformei de secvențiere a nanoporilor și a strungului în ansamblul MAG.Un total de date de 30,3 Gb a fost generat de platforma nanopore cu N50 de 5,9 kb.Strungul a îmbunătățit în mare măsură asamblarea N50 la 1,6 până la 4 ori în comparație cu alte scule de asamblare cu citire lungă și de 2 până la 9 ori în comparație cu uneltele de asamblare hibride.Din 12 genomi bacterieni, șapte au fost asamblați în contig unice (Figura 3. Circos cu punct negru).Alte trei au fost asamblate în patru sau mai puține contig-uri, în care cel mai incomplet ansamblu conținea 83% din genom într-un singur contig.
Figura 3. Ansambluri de genom într-un amestec bacterian definit de 12 specii
Aplicarea strungului în probe de scaun
Această metodă a fost aplicată în continuare probelor de scaun uman pentru a compara identificarea organismului și contiguitatea ansamblului cu metodele existente, analiza în nor de citire și analiza pe bază de citire scurtă.Din cele trei probe implicate, noua extracție pe bază de enzime a produs cel puțin 1 μg la 300 mg de masă de intrare.Secvențierea prin nanopori a acestor ADN HMW a generat citiri lungi cu N50 de 4,7 kb, 3,0 kb și, respectiv, 3,0 kb.În special, metoda actuală a arătat un potențial mare în detectarea microbiană în comparație cu metodele existente.Diversitatea alfa la nivel de specie relativ mai mare a fost arătată aici în comparație cu citirea scurtă și norul de citire.Mai mult, toate genurile din analiza scurtă, chiar și organisme Gram pozitive rezistente la liză, au fost recuperate prin această metodă.
Figura 4. Diversitatea alfa și componentele taxonomice determinate prin Nanopore, metode de citire scurtă și nor de citire
Strungul a dat un ansamblu N50 mult mai lung decât ansamblul cu citire scurtă și citire în cloud, în ciuda unei intrări de date brute de trei până la șase ori mai reduse.Schițele de genom au fost produse prin contig binning, în care schițele au fost clasificate în „de înaltă calitate” sau „parțiale” pe baza caracterului complet, contaminare, gene de bază cu o singură copie, etc. la citire scurtă și citire în cloud.
Figura 5. Contigüitatea ansamblului per-organism al fiecărei metode
Mai mult, abordarea actuală de asamblare este capabilă să producă genomi circulari închisi.În probele de scaun, au fost asamblați opt genomi de înaltă calitate, cu un singur contig, iar cinci dintre aceștia au realizat o circularizare precisă.Abordarea citită îndelungată a arătat, de asemenea, o capacitate impresionantă în rezolvarea elementelor repetitive din genom.CircularizatP. coprigenomul a fost generat de această abordare, despre care se știe că conține un grad ridicat de repetiție a secvenței.Cel mai bun ansamblu al acestui genom prin citire scurtă și citire în nor nu a depășit niciodată N50 de 130 kb, chiar și cu adâncimea de acoperire de 4800X.Aceste elemente cu un număr mare de copii au fost complet rezolvate prin abordarea de citire lungă, care se găsește adesea în punctele de întrerupere ale ansamblurilor de citire scurtă sau de citire în cloud.Un alt genom închis a fost raportat în acest studiu, despre care se credea că este un membru al descris recentCibiobactercladă.În acest ansamblu închis au fost identificați cinci fagi presupusi, variind de la 8,5 la 65,9 kb.
Figura 6. Diagrama Circos a genomurilor închise ale P.copri și Cibiobacter sp.
Referinţă
Moss, EL, Maghini, DG și Bhatt, AS (2020).Genoame bacteriene complete și închise din microbiom folosind secvențierea nanoporilor.Biotehnologia naturii,38(6), 701-707.
Tehnologie și Repere își propune să împărtășească cele mai recente aplicații de succes a diferitelor tehnologii de secvențiere de mare debit în diverse domenii de cercetare, precum și idei geniale în designul experimental și extragerea datelor.
Ora postării: 07-ian-2022