GENOMICA UMANĂ
genetica naturii
Secvențierea cu citire lungă identifică expansiunile repetate GGC în NOTCH2NLC asociate cu boala de incluziune intranucleară neuronală
resecventilare ONT |Illumina |Secvențierea întregului exom |Secvențierea vizată CRISPR-Cas9 ONT |ARN-sev |ONT 5mC chemare de metilare
Repere
1. Prin analiza legăturii pe o familie mare de NIID, au fost identificate două regiuni legate.
2. Secvențierea de citire lungă bazată pe ONT și secvențierea ONT de îmbogățire mediată de Cas-9 au descoperit o cauză genetică potențială a expansiunilor repetate de NIID, GGC în 5′ UTR a NOTCH2NLC.Acest studiu a raportat expansiuni repetate în gene specifice omului, pentru prima dată, care au evoluat prin dublări segmentare.
3. Secvențierea ARN a dezvăluit transcrieri antisens anormale la început sau în interiorul regiunilor de expansiune repetate GGC în NOTCH2NLC.
fundal
Nboala de incluziune intranucleară euronală (NIID) este o boală neurodegenerativă progresivă și fatală, care se caracterizează prin prezența incluziunilor intranucleare hialine eozinofile în sistemul nervos central și periferic.Manifestările sale clinice foarte variabile ridică mari dificultăți în diagnostic până la introducerea biopsiei cutanate.Cu toate acestea, metodele bazate pe histopatologie suferă încă de diagnosticare greșită, ceea ce necesită o înțelegere genetică a NIID.
Realizări
Analiza legăturii
SSecvențierea cu citire hort bazată pe secvențierea întregului genom (WGS) și secvențierea întregului exom (WES) au fost efectuate pe o familie mare de NIID (13 membri afectați și 7 membri neafectați).Analiza legăturii asupra SNP-urilor extrase din aceste date a relevat doar două regiuni legate: o regiune de 3,5 Mb la 1p36.31-p36.22 (LOD maxim = 2,32) și o regiune de 58,1 Mb la 1p22.1-q21.3 (LOD maxim: 4,21). ).Cu toate acestea, nu au fost identificate SNP sau CNV patogeni în aceste regiuni legate.
GGC repetă expansiunile în NOTCH2NLC
NSecvențierea pe bază de anopor a fost procesată pe 13 membri afectați și 4 neafectați din 8 familii (un alt membru afectat a fost secvențiat de platforma de secvențiere de lungă durată Pacbio.).Datele citite îndelung au evidențiat expansiuni repetate GGC asociate bolii în 5′ UTR a cartografierii genei NOTCH2NLC la regiunea legată de 58,1 Mb (Figura 1).Aceste expansiuni repetate au fost identificate, de asemenea, în toate cele 40 de cazuri sporadice de NIID testate prin RP-PCR.
CSecvențierea țintă mediată de as-9 pe platforma nanoporului a fost folosită pentru a obține o acoperire de citire mai mare pe repetarea NOTCH2NLC (100 X-1.795 X).Aceste secvențe de consens au fost de acord cu descoperirile anterioare privind expansiunile repetate GGC.Mai mult, repetările {(GGA)n (GGC)n}n au fost identificate ca un potențial marker genetic pentru fenotipul dominant de slăbiciune (Figura 2).
Figura 1. Expansiunea repetată asociată bolii identificată pe exonul 1 al izoformelor NOTCH2NLC.
Figura 2. Secvențe consens de repetare NPTCH2NLC la pacienții cu NIID cu (*) sau fără fenotip dominant de slăbiciune
NGenele OTCH2NL sunt gene specifice omului, despre care se crede că joacă un rol vital în evoluția creierului uman și în bolile neurologice.Cu toate acestea, trei gene înrudite cu NOTCH2 (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB și NOTCH2NLC) cu identitate de secvență > 99,1% nu au fost rezolvate până la cea mai recentă asamblare a genomului uman.Secvențierea fără sinteză și cu citire lungă pe platforma nanoporilor au arătat avantaje notabile în rezolvarea regiunilor cu similaritate ridicată și a repetărilor (GGC)n cu 100% bogat în GC.
GGC repetă expansiunile în NOTCH2NLC
TSecvențierea ranscriptomului a fost procesată pe 2 membri afectați și 2 neafectați.Adâncimea de citire normalizată a fost calculată pe firele sens și antisens în amonte de primii exoni ai paralogilor NOTCH2NL.Transcrierile anti-sens anormale au fost găsite numai în cazurile afectate, care se află la începutul sau în interiorul regiunii de expansiune repetă (vârfurile violet în F1-14 și F1-16 în Figura 3.).În plus, au fost identificate 54 DEG și toate au fost îmbogățite în termeni GO și MPO legați de funcțiile neuronale.
Figura 3. Adâncimea de citire normalizată în amonte de primul exon al NOTCH2NLC în cazurile neafectate (de mai sus) și afectate (de mai jos).
Tehnologie
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
Nsecvențierea anoporelor se distinge de alte platforme de secvențiere, prin aceea că nucleotidele sunt citite direct fără proces de sinteză a ADN-ului.Pe măsură ce ADN-ul cu o singură catenă trece printr-un por de proteine de mărime nanometrică (nanopor), diferite nucleotide generează diferiți curenți ionici, care pot fi capturați și transferați în secvența de baze.Platforma de secvențiere ONT în sine nu prezintă o limită tehnică aparentă a duratei citirii ADN-ului.Prin urmare, citirile ultra-lungi (ULR) sunt disponibile pentru asamblarea genomului de înaltă calitate.Mai mult decât atât, aceste citiri extrem de lungi, care sunt suficient de lungi pentru a traversa caracteristicile secvențelor complexe sau variațiile structurale, ajută la depășirea limitărilor secvențierii de citire scurtă aici.
Secvențierea nanoporilor
Identificarea variației structurii (SV).
Ssecvențierea fără sinteza a păstrat în mare măsură informațiile de metilare a ADN-ului pe șablon.A, T, C și G metilati generează curenți ionici distincți de cei nemetilați, care pot fi cititi direct de platformă.Secvențierea nanoporilor împuternicește profilarea întregului genom atât a 5mC, cât și a 6mA la rezoluție cu o singură nucleotidă.
Referinţă
Jun Sone, et.al.Secvențierea cu citire lungă identifică expansiunile repetate GGC în NOTCH2NLC asociate cu boala de incluziune intranucleară neuronală.Genetica naturii (2019)
Tehnologie și Repere își propune să împărtășească cele mai recente aplicații de succes a diferitelor tehnologii de secvențiere de mare debit în diverse domenii de cercetare, precum și idei geniale în designul experimental și extragerea datelor.
Ora postării: 06-ian-2022