TRANSSCRIPTOMICA
natură
COMUNICAȚII
Caracterizarea transcripției de lungime completă a mutației SF3B1 în leucemia limfocitară cronică dezvăluie reglarea în jos a intronilor reținuți
Stenograme integrale|Secvențierea nanoporilor|Analiza alternativă a izoformelor
fundal
SS-a raportat pe scară largă că mutațiile omatice ale factorului de splicing SF3B1 se asociază cu diferite tipuri de cancer, inclusiv leucemia limfocitară cronică (LLC), melanomul uveal, cancerul de sân etc.Cu toate acestea, studiile asupra acestor modele alternative de îmbinare s-au limitat de mult la nivel de eveniment și la lipsa de cunoștințe la nivel de izoforme din cauza limitării transcrierilor asamblate cu citire scurtă.Aici, platforma de secvențiere a nanoporilor a fost introdusă pentru a genera transcrieri de lungime completă, care a împuternicit inverstigarea pe izoformele AS.
Design experimental
Experimente
Grupare:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1 (mutație K700E);3. Celule B normale
Strategia de secvențiere:Secvențierea bibliotecii MinION 2D, secvențierea bibliotecii PromethION 1D;date scurte de citire din aceleași mostre
Platformă de secvențiere:ONT Minion;ONT PromethION;
Analiza Bioinformatică
Rezultate
Aau fost generate un total de 257 de milioane de citiri din 6 probe de CLL și 3 celule B.În medie, 30,5% dintre aceste lecturi au fost identificate ca transcrieri integrale.
FAnaliza alternativă a izoformelor de ARN (FLAIR) de lungă durată a fost dezvoltată pentru a genera un set de izoforme de înaltă încredere.FLAIR poate fi rezumat astfel:
Nanopore citește alinierea: identificați structura generală a transcripției pe baza genomului de referință;
Scorecția joncțiunii plice: corectați erorile de secvență (roșu) cu site-ul de îmbinare fie de la introni adnotați, fie de la datele de citire scurtă sau ambele;
Collapse: rezumă izoformele reprezentative pe baza lanțurilor de joncțiune de îmbinare (setul de primă trecere).Selectați o izolare de încredere ridicată din baza numărului de citiri compatibile (Prag: 3).
Figura 1. Analiza FLAIR pentru a identifica izoformele de lungime completă asociate cu mutația SF3B1 în LLC
FLAIR a identificat 326.699 de izoforme îmbinate de mare încredere, dintre care 90% sunt izoforme noi.Majoritatea acestor izoforme neadnotate s-au dovedit a fi combinații noi de joncțiuni de îmbinare cunoscute (142.971), în timp ce celelalte izoforme noi conțineau fie intron reținut (21.700) fie exonul nou (3594).
Lsecvențele ong-read împuternicesc identificarea site-urilor de îmbinare modificate SF3B1-K700E mutante la nivel de izoforme.35 alternative 3'SS și 10 alternative 5'SS s-au dovedit a fi îmbinate diferențiat semnificativ între SF3B1-K700E și SF3B1-WT.33 din cele 35 de modificări au fost descoperite recent prin secvențe de citire lungă.În datele Nanopore, distribuția distanței dintre 3'SS modificate de SF3B1-K700E la vârfurile site-urilor canonice este de aproximativ -20 bp, care diferă semnificativ de o distribuție de control, similar cu ceea ce a fost raportat în secvențele de citire scurtă CLL.Au fost analizate izoforme ale genei ERGIC3, unde o izoformă nouă care conține locul de îmbinare proximal a fost găsită mai abundentă în SF3B1-K700E.Atât SS-ul proximal, cât și cel distal au fost asociate cu modele AS distincte care generează izoforme multiple.
Figura 2. Modele alternative de îmbinare 3′ identificate cu date de secvențiere a nanoporilor
Analiza utilizării evenimentelor IR a fost mult timp limitată în analiza pe bază de citire scurtă datorită încrederii în identificarea și cuantificarea IR.Expresia izoformelor IR în SF3B1-K700E și SF3B1-WT a fost cuantificată pe baza secvențelor de nanopori, dezvăluind o reglare globală în jos a izoformelor IR în SF3B1-K700E.
Figura 4. Intensitatea agriculturii și conectivitate la rețea în trei sisteme agricole (A și B);Analiza aleatorie a pădurilor (C) și relația dintre intensitatea agriculturii și colonizarea AMF (D)
Figura 3. Evenimentele de retentie a intronilor sunt mai puternic reglate în jos în CLL SF3B1-K700E
Tehnologie
Secvențierea de citire lungă Nanopore
Nsecvențierea anoporelor este o tehnologie de secvențiere a semnalului electric în timp real cu o singură moleculă.
DADN-ul sau ARN-ul dublu catenar se va lega de proteina nanoporoasă încorporată în biofilm și se va desfășura sub conducerea proteinei motorii.
DCatenele NA/ARN trec prin proteina canalului nanoporului cu o anumită rată sub acțiunea diferenței de tensiune.
Moleculele generează semnale electrice diferite în funcție de structura chimică.
Rdetectarea în timp util a secvenţelor se realizează prin apelarea de bază.
Performanța secvențierii transcriptomului de lungime completă
√ Saturația datelor
Sunt necesare de 7 ori mai puține citiri pentru a atinge o saturație comparabilă a datelor.
√ Identificarea structurii transcripției
Identificarea diferitelor variante structurale cu citire consensuală pe lungime completă a fiecărei transcrieri
√ Analiză diferențială la nivel de transcriere - Dezvăluie modificări ascunse de citirile scurte
Referinţă
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Caracterizarea transcripției de lungime completă a mutației SF3B1 în leucemia limfocitară cronică dezvăluie reglarea în jos a intronilor reținuți [J].Comunicarea naturii.
Tehnologie și Repere își propune să împărtășească cele mai recente aplicații de succes a diferitelor tehnologii de secvențiere de mare debit în diverse domenii de cercetare, precum și idei geniale în designul experimental și extragerea datelor.
Ora postării: 08-ian-2022