RESECVENIREA ÎNTREGIULUI GENOM
Monitorizarea genomică a SARS-CoV-2 descoperă o variantă de ștergere a Nsp1 care modulează răspunsul la interferon de tip I
Nanopore |Illumina |Resecvențierea întregului genom |metagenomica |ARN-Seq |Sanger
Biomarker Technologies a oferit suport tehnic pentru secvențierea probelor în acest studiu.
Repere
1.Secvențierea genomului SARS-CoV-2 și analiza filognetică identifică 35 de mutații recurente, inclusiv 31 de SNP și 4 Indel.
2.Asocierea cu 117 fenotipuri clinice relevă potențial
mutații importante.
∆500-532 în regiunea de codificare Nsp1 se corelează cu virusul inferior
3.încărcare și IFN-β seric.
4. Izolatele virale cu mutația ∆500-532 induc IFN-I mai scăzut
răspuns în celulele infectate.
Design experimental
Realizări
1. Supravegherea epidemiologică și genomică COVID-19
Datele clinice au fost colectate în provincia Sichuan, China, în perioada focarului din 22 ianuarie 2020 până în 20 februarie 2020. Un total de 538 de cazuri de COVID-19 au fost confirmate prin teste qPCR în Sichuan, dintre care 28,8% au fost din provincie. capital.Cazurile confirmate în Sichuan au crescut exponențial, atingând vârful pe 30 ianuarie.De asemenea, datele au susținut că distanțarea socială poate fi un factor cheie în prevenirea răspândirii virusului.
Figura 1. Studiu epidemiologic al COVID-19 în provincia Sichuan, China
2. Construcția genomului SARS-CoV-2 și identificarea variantelor
Cu amplificare PCR multiplex urmată de secvențierea nanoporilor, au fost generați un total de 310 genomi aproape complet sau parțial de la 248 de pacienți cu aprox.80% din genomi sunt acoperite de 10 citiri (adâncime medie: 0,39 M citiri per probă).
Figura 2. Frecvența fiecărei variante din cohorta Sichuan
Un total de 104 SNP și 18 Indels au fost identificați din genomul SARS-CoV-2, în care 31 SNP și 4 Indels au fost identificați ca variante genetice recurente.Comparându-le cu 169 de mostre de la Wuhan și cu 81.391 de secvențe de genom publich de înaltă calitate din GISAID, 29 din cele 35 de variante găsite au fost prezentate pe alte continente.În special, patru variante, inclusiv ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 și T13243C, au fost găsite a fi prezente numai în Sichuan și Wuhan și absente în datele GISAID, indicând faptul că aceste variante au fost foarte probabil să fie îmbunătățite de la Wuhan, care îndeplinesc cerințele. fișele de călătorie ale pacienților.
Analiza evolutivă cu metoda de probabilitate maximă (ML) și abordări ale ceasului molecular bayesian a fost procesată pe 88 de virusuri noi din Sichuan și 250 de genomi curați din alte regiuni.Genoamele cu ∆500-532 (Deleții în regiunea codificatoare Nsp1) au fost găsite distribuite slab în arborele filogenetic.Analiza haplotipului asupra variantelor Nsp1 a identificat 5 dintre ele din mai multe orașe.Aceste rezultate au sugerat că ∆500-532 a avut loc în mai multe orașe și ar putea fi importat de mai multe ori din Wuhan.
Figura 2. Variante genetice recurente și analiză filogenetică în genomii SARS-CoV-2
3. Asocierea variantelor genetice recurente cu implicații clinice
117 fenotipuri clinice au fost asociate cu severitatea COVID-19, unde 19 fenotipuri legate de severitate au fost clasificate în trăsături severe și non-severe.Relația dintre aceste trăsături și 35 de variante genetice recurente au fost vizualizate în harta termică bi-cluster.O analiză de îmbogățire clasificată asemănătoare GSEA a arătat că ∆500-532 este corelat negativ cu numărul de celule T din sânge, VSH, IFN-β seric și CD3+CD8+.Mai mult, testele qPCR au arătat că pacienții infectați cu virus care adăpostesc ∆500-532 au avut cea mai mare valoare Ct, adică cea mai mică încărcătură virală.
Figura 3. Asocieri a 35 de variante genetice recurente cu fenotipuri clinice
4. Validarea fenotipurilor clinice asociate mutațiilor virale
Pentru a înțelege efectele ∆500-532 asupra funcțiilor Nsp1, celulele HEK239T au fost transfectate cu plasmide care exprimă forme de lungime completă, WT Nsp1 și mutante cu deleții.Profilurile transcriptomului fiecărei celule HEK239T tratate au fost procesate pentru analiza PCA, arătând că mutanții de deleție s-au grupat relativ mai aproape și au fost semnificativ diferiți de WT Nsp1.Genele care au fost semnificativ upregulate la mutanți au fost îmbogățite în principal în „procesul biosintetic/metabolic al peptidei”, „biogeneza complexului ribonucleoproteic”, „țintirea proteinei către membrană/ER”, etc. În plus, două deleții au arătat un model de expansiune distinct față de WT.
Figura 4. Analiza transcriptomului pe celule HEK239T transfectate de WT Nsp1 și cea cu deleții
Efectele delețiilor asupra răspunsului IFN-1 au fost, de asemenea, testate într-un studiu supraexprimat.S-a demonstrat că toate ștergerile testate reduc repzona IFN-1 în celulele HEK239T și A549 transfectate atât la nivel de transcriptom, cât și la nivel de proteină.În mod interesant, genele reglate în mod semnificativ în deleții au fost îmbogățite în „răspunsul de apărare la virus”, „replicarea genomului viral”, „reglarea transcripției prin ARN polimeraza II” și „răspuns la interferonul de tip I”.
Figura 5. Reglarea în jos a căilor de semnalizare a interferonului în mutantul ∆500-532
În acest studiu, impactul acestor ștergeri asupra virusului a fost confirmat în continuare de studiile privind infecțiile virale.Virușii cu anumiți mutanți au fost izolați din probele clinice și infectați cu celule Calu-3.Rezultatele detaliate ale studiului infecțiilor virale pot fi citite în lucrare.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Referinţă
Lin J, Tang C, Wei H, și colab.Monitorizarea genomică a SARS-CoV-2 descoperă o variantă de ștergere a Nsp1 care modulează răspunsul la interferon de tip I [J].Gazdă celulară și microbi, 2021.
Știri și Repere își propune să împărtășească cele mai recente cazuri de succes cu Biomarker Technologies, surprinzând realizări științifice noi, precum și tehnici proeminente aplicate în timpul studiului.
Ora postării: 06-ian-2022