Secvențierea ARNm de lungime completă -PacBio
Avantajele serviciului
● Citirea directă a moleculei de ADNc de lungime completă de la capătul 3’ la capătul 5’
● Rezoluție la nivel de formă iso în structura secvenței
● Transcrieri cu acuratețe și integritate ridicate
● Foarte compatibil cu diverse specii
● Capacitate mare de secvențiere cu 4 platforme de secvențiere PacBio Sequel II echipate
● Cu o mare experiență în peste 700 de proiecte de secvențiere a ARN pe bază de Pacbio
● Livrarea rezultatelor pe bază de BMKCloud: extragerea de date personalizată disponibilă pe platformă.
● Servicii post-vânzare valabile 3 luni la finalizarea proiectului
Specificații de service
Platformă: PacBio Sequel II
Biblioteca de secvențiere: bibliotecă de ARNm îmbogățită cu Poly A
Randament de date recomandat: 20 Gb/probă (în funcție de specie)
FLNC（%）： ≥75%
*FLNC: transcipturi non-himerice de lungime completă
Analize bioinformatice
● Prelucrarea datelor brute
● Identificarea transcriptului
● Structura secvenţei
● Cuantificarea expresiei
● Adnotare funcție
Cerințe pentru mostre și livrare
Cerințe pentru eșantion:
Nucleotide:
| Conc. (ng/μl) | Cantitate (μg) | Puritate | Integritate |
| ≥ 120 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Contaminare limitată sau lipsită de proteine sau ADN este indicată pe gel. | Pentru plante: RIN≥7,5; Pentru animale: RIN≥8,0; 5,0≥ 28S/18S≥1,0; creștere limitată sau inexistentă |
Țesut: Greutate (uscat):≥1 g
*Pentru țesutul mai mic de 5 mg, vă recomandăm să trimiteți probă de țesut congelată rapid (în azot lichid).
Suspensie celulară:Număr de celule = 3×106- 1×107
*Recomandăm să expediați lizat de celule congelate.În cazul în care acea celulă numără mai puțin de 5×105, se recomandă congelarea rapidă în azot lichid, ceea ce este de preferat pentru micro extracție.
Mostre de sânge:Volum ≥1 ml
Microorganism:Masa ≥ 1 g
Livrare recomandată de mostre
Container:
Tub de centrifuga de 2 ml (nu este recomandata folie de cositor)
Etichetarea eșantionului: Grup+replicat de exemplu A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Expediere:
1. Gheață carbonică: Probele trebuie ambalate în saci și îngropate în gheață carbonică.
2. Tuburi ARNstable: Probele de ARN pot fi uscate în tub de stabilizare a ARN (de exemplu, RNAstable®) și expediate la temperatura camerei.
Fluxul de lucru al serviciului
Design experiment
Livrare mostre
extracția ARN
Construcția bibliotecii
Secvențierea
Analiza datelor
Servicii post-vânzare
1.Distribuția lungimii FLNC
Lungimea citirii non-himerice de lungime completă (FLNC) indică lungimea cADN-ului în construcția bibliotecii.Distribuția lungimii FLNC este un indicator crucial în evaluarea calității construcției bibliotecii.
Distribuția lungimii de citire FLNC
2. Distribuția completă a lungimii regiunii ORF
Folosim TransDecoder pentru a prezice regiunile de codificare a proteinelor și secvențele de aminoacizi corespunzătoare pentru a genera seturi unigene, care conține informații complete de transcriere neredundante în toate probele.
Distribuție completă a lungimii regiunii ORF
3. Analiza îmbogățirii căii KEGG
Transcrierile exprimate diferențial (DET) pot fi identificate prin alinierea datelor de secvențiere a ARN pe bază de NGS pe seturi de transcriere de lungime completă generate de datele de secvențiere PacBio.Aceste DET-uri pot fi prelucrate în continuare pentru diferite analize funcționale, de exemplu, analiza de îmbogățire a căii KEGG.
Îmbogățirea căii DET KEGG -Dot plot
Carcasa BMK
Dinamica dezvoltării transcriptomului tulpină Populus
Publicat: Revista de biotehnologie a plantelor, 2019
Strategia de secvențiere:
Colectie de mostre:regiuni de tulpină: apex, primul internod (IN1), al doilea internod (IN2), al treilea internod (IN3), internod (IN4) și internod (IN5) de la Nanlin895
secvență NGS:ARN-ul a 15 indivizi a fost reunit ca o singură probă biologică.Trei replici biologice ale fiecărui punct au fost procesate pentru secvența NGS
Secvența TGS:Regiunile stem au fost împărțite în trei regiuni, adică apex, IN1-IN3 și IN4-IN5.Fiecare regiune a fost procesată pentru secvențierea PacBio cu patru tipuri de biblioteci: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb și 3-10 kb.
Rezultate cheie
1. Au fost identificate un total de 87150 de transcrieri de lungime completă, în care au fost identificate 2081 de izoforme noi și 62058 de izoforme noi de îmbinare alternative.
Au fost identificate 2,1187 lncRNA și 356 gene de fuziune.
3.De la creșterea primară la creșterea secundară, au fost identificate 15838 transcrieri exprimate diferențial din 995 gene exprimate diferențial.În toate DEG, 1216 au fost factori de transcripție, dintre care majoritatea nu au fost încă raportați.
Analiza de îmbogățire 4.GO a relevat importanța diviziunii celulare și a procesului de oxidare-reducere în creșterea primară și secundară.
Evenimente alternative de îmbinare și izoforme diferite
Analiza WGCNA asupra factorilor de transcripție
Referinţă
Chao Q, Gao ZF, Zhang D și colab.Dinamica dezvoltării transcriptomului tulpină Populus.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958
