METAGENOMIA
Genomas bacterianos completos e fechados de microbiomas usando sequenciamento de nanoporos
Sequenciamento de Nanoporos |Metagenômica |MAGs |Circularização do genoma bacteriano |Microbiota intestinal
Destaques
1. Um novo método para extrair longos fragmentos de DNA foi apresentado neste estudo, que obteve a extração de microgramas de DNA HMW puro adequado para sequenciamento de leitura longa a partir de 300 mg de fezes
2.Um fluxo de trabalho de montagem, Torno, foi introduzido neste estudo, onde os MAGs foram montados por leituras longas e corrigidos por leituras curtas.
3.O torno foi avaliado por mistura simulada.7 das 12 bactérias foram montadas com sucesso em contigs únicos e 3 foram montadas em quatro ou menos contigs.
4.O torno foi posteriormente aplicado em amostras de fezes, o que gerou 20 genomas circularizados, incluindo Prevotella copri e a candidata Cibiobacter sp., que eram conhecidos por serem ricos em elementos genéticos móveis.
Realização Principal
Protocolo de extração para DNA HWM
Estudos metagenômicos intestinais baseados em sequenciamento de leitura longa há muito sofrem com a dificuldade na extração de DNA de alto peso molecular (HMW) das fezes.Neste estudo, um protocolo de extração baseado em enzimas foi introduzido para evitar cisalhamento extenso por batimento de esferas em métodos tradicionais.Conforme mostrado na figura a seguir, as amostras foram primeiramente tratadas com um coquetel de enzimas, incluindo enzima lítica, MetaPolyzyme, etc., para degradar as paredes celulares.O DNA liberado foi extraído pelo sistema Fenol-clorofórmio, seguido por digestão com Proteinase K e RNase A, purificação baseada em coluna e seleção de tamanho SPRI.Este método conseguiu produzir microgramas de DNA HMW a partir de 300 m de fezes, o que atende aos requisitos de sequenciamento de leitura longa em termos de qualidade e quantidade.
Figura 1. Esquema de extração de DNA HWM
Fluxo do esquema do torno
Conforme descrito na figura a seguir, o Lathe contém o processo existente de processo de chamada de base bruta usando Guppy.Dois conjuntos de leitura longa são então produzidos por Flye e Canu separadamente, seguidos pela detecção e remoção de montagem incorreta.As duas submontagens são mescladas com quickmerge.Após a fusão, grandes montagens no nível da megabase são verificadas quanto à circularização.Posteriormente, o refinamento do consenso nessas montagens é processado com leituras curtas.Os genomas bacterianos montados finais são processados para detecção e remoção final de montagem incorreta.
Figura 2. Esquema de fluxo da montagem do Torno
Avaliação de torno com mistura simulada de bactérias
Uma mistura padrão de 12 espécies ATCC compreendendo bactérias Gram-positivas e Gram-negativas foi empregada para avaliar o desempenho da plataforma de sequenciamento de nanoporos e do torno na montagem MAG.Um total de 30,3 Gb de dados foi gerado pela plataforma nanopore com N50 de 5,9 kb.O torno melhorou amplamente a montagem N50 para 1,6 a 4 vezes em comparação com outras ferramentas de montagem de leitura longa e 2 a 9 vezes em comparação com ferramentas de montagem híbridas.Dos 12 genomas bacterianos, sete foram montados em contigs únicos (Figura 3. Circos com ponto preto).Mais três foram montados em quatro ou menos contigs, nos quais a montagem mais incompleta continha 83% do genoma em um único contig.
Figura 3. Conjuntos de genomas em uma mistura bacteriana definida de 12 espécies
Aplicação de Torno em amostras de fezes
Este método foi posteriormente aplicado a amostras de fezes humanas, a fim de comparar a identificação do organismo e a contiguidade da montagem com os métodos existentes, análise baseada em nuvem de leitura e leitura curta.Das três amostras envolvidas, a nova extração baseada em enzima rendeu pelo menos 1 μg por 300 mg de massa de entrada.O sequenciamento de nanoporos desses DNA de HMW gerou leituras longas com N50 de 4,7 kb, 3,0 kb e 3,0 kb, respectivamente.Notavelmente, o presente método mostrou grande potencial na detecção microbiana em comparação com os métodos existentes.Diversidade alfa relativamente maior em nível de espécie foi mostrada aqui em comparação com leitura curta e nuvem de leitura.Além disso, todos os géneros provenientes de análises de leitura curta, mesmo organismos Gram-positivos tipicamente resistentes à lise, foram recuperados por este método.
Figura 4. Diversidade alfa e componentes taxonômicos determinados pelos métodos Nanopore, leitura curta e nuvem de leitura
O torno rendeu uma montagem completa do N50 muito mais longa do que a montagem de leitura curta e de leitura em nuvem, apesar de uma entrada de três a seis vezes menor de dados brutos.Rascunhos de genomas foram produzidos por contig binning, no qual os rascunhos foram classificados em “alta qualidade” ou “parcial” com base na integridade, contaminação, genes centrais de cópia única, etc. para leitura curta e leitura em nuvem.
Figura 5. Contiguidade de montagem por organismo de cada método
Além disso, a presente abordagem de montagem é capaz de produzir genomas circulares fechados.Nas amostras de fezes, oito genomas de contig único de alta qualidade foram montados e cinco deles alcançaram circularização perfeita.A abordagem de leitura longa também mostrou capacidade impressionante na resolução de elementos repetitivos em genomas.CircularizadoP.copriO genoma foi gerado por esta abordagem, que é conhecida por conter um alto grau de repetição de sequência.A melhor montagem deste genoma por leitura curta e nuvem de leitura nunca ultrapassou N50 de 130 kb, mesmo com profundidade de cobertura de 4800X.Esses elementos de alto número de cópias foram totalmente resolvidos pela abordagem de leitura longa, que geralmente ocorre em pontos de ruptura de montagens de leitura curta ou de nuvem de leitura.Outro genoma fechado foi relatado neste estudo, que se acredita ser um membro do grupo recentemente descritoCibiobacterclado.Cinco supostos fagos foram identificados nesta montagem fechada, variando de 8,5 a 65,9 kb.
Figura 6. Diagrama Circos de genomas fechados de P.copri e Cibiobacter sp.
Referência
Moss, EL, Maghini, DG e Bhatt, AS (2020).Genomas bacterianos completos e fechados de microbiomas usando sequenciamento de nanoporos.Biotecnologia da natureza,38(6), 701-707.
Tecnologia e destaques visa compartilhar as mais recentes aplicações bem-sucedidas de diferentes tecnologias de sequenciamento de alto rendimento em diversas áreas de pesquisa, bem como ideias brilhantes em design experimental e mineração de dados.
Horário da postagem: 07 de janeiro de 2022