RESEQUENIZAÇÃO DO GENOMA COMPLETO
O monitoramento genômico do SARS-CoV-2 revela uma variante de deleção de Nsp1 que modula a resposta do interferon tipo I
Nanoporo |Iluminar |Resequenciação completa do genoma |metagenômica |RNA-Seq |Sanger
A Biomarker Technologies forneceu suporte técnico no sequenciamento de amostras neste estudo.
Destaques
1. O sequenciamento do genoma do SARS-CoV-2 e a análise filogenética identificam 35 mutações recorrentes, incluindo 31 SNPs e 4 Indels.
2.A associação com 117 fenótipos clínicos revela potencial
mutações importantes.
∆500-532 na região de codificação Nsp1 se correlaciona com menor número viral
3.carga e IFN-β sérico.
4. Isolados virais com mutação ∆500-532 induzem menor IFN-I
resposta nas células infectadas.
Design experimental
Conquistas
1. Vigilância epidemiológica e genómica da COVID-19
Os dados clínicos foram coletados na província de Sichuan, China, durante o período do surto, de 22 de janeiro de 2020 a 20 de fevereiro de 2020. Um total de 538 casos de COVID-19 foram confirmados por testes qPCR em Sichuan, 28,8% dos quais eram da província capital.Os casos confirmados em Sichuan aumentaram exponencialmente, atingindo o pico em 30 de janeiro.Além disso, os dados apoiam que o distanciamento social pode ser um factor chave na prevenção da propagação do vírus.
Figura 1. Estudo epidemiológico da COVID-19 na província de Sichuan, China
2. Construção do genoma do SARS-CoV-2 e identificação de variantes
Com amplificação por PCR multiplex seguida de sequenciamento de nanoporos, um total de 310 genomas quase completos ou parcialmente completos de 248 pacientes foram gerados com aprox.80% dos genomas cobertos por 10 leituras (profundidade média: 0,39 M de leituras por amostra).
Figura 2. Frequência de cada variante na coorte de Sichuan
Um total de 104 SNPs e 18 Indels foram identificados a partir dos genomas do SARS-CoV-2, nos quais 31 SNPs e 4 Indels foram identificados como variantes genéticas recorrentes.Ao compará-los com 169 amostras de Wuhan e com 81.391 sequências do genoma público de alta qualidade no GISAID, 29 das 35 variantes encontradas foram apresentadas em outros continentes.Notavelmente, quatro variantes, incluindo ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 e T13243C, só foram encontradas presentes em Sichuan e Wuhan e ausentes nos dados do GISAID, indicando que essas variantes eram muito provavelmente importadas de Wuhan, que atendem aos registros de viagens de pacientes.
A análise evolutiva com método de máxima verossimilhança (ML) e abordagens de relógio molecular bayesiano foi processada em 88 novos vírus de Sichuan e 250 genomas curados de outras regiões.Genomas com ∆500-532 (deleções na região codificadora de Nsp1) foram encontrados distribuídos esparsamente na árvore filogenética.A análise de haplótipos nas variantes Nsp1 identificou 5 delas em várias cidades.Estes resultados sugeriram que o ∆500-532 ocorreu em múltiplas cidades e pode ser importado múltiplas vezes de Wuhan.
Figura 2. Variantes genéticas recorrentes e análise filogenética nos genomas do SARS-CoV-2
3. Associação de variantes genéticas recorrentes com implicações clínicas
117 fenótipos clínicos foram associados à gravidade da COVID-19, onde 19 fenótipos relacionados à gravidade foram classificados em características graves e não graves.A relação entre essas características e 35 variantes genéticas recorrentes foi visualizada em mapa de calor bi-cluster.Uma análise de enriquecimento classificada semelhante à GSEA mostrou que ∆500-532 está negativamente correlacionado com VHS, IFN-β sérico e contagens de células T CD3+CD8+ no sangue.Além disso, os testes qPCR mostraram que os pacientes infectados com vírus portadores de ∆500-532 apresentaram o valor Ct mais alto, ou seja, a carga viral mais baixa.
Figura 3. Associações de 35 variantes genéticas recorrentes com fenótipos clínicos
4. Validação de fenótipos clínicos associados a mutações virais
A fim de compreender os efeitos de ∆500-532 nas funções Nsp1, as células HEK239T foram transfectadas com plasmídeos expressando Nsp1 WT completo e formas mutantes com deleções.Os perfis do transcriptoma de cada célula HEK239T tratada foram processados para análise de PCA, mostrando que os mutantes de deleção agrupavam-se relativamente mais próximos e eram significativamente diferentes do WT Nsp1.Os genes que foram significativamente regulados positivamente nos mutantes foram enriquecidos principalmente em “processo biossintético/metabólico de peptídeos”, “biogênese do complexo ribonucleoproteico”, “proteína direcionada à membrana/ER”, etc.
Figura 4. Análise do transcriptoma em células HEK239T transfectadas por WT Nsp1 e com deleções
Os efeitos das deleções na resposta do IFN-1 também foram testados em estudos superexpressos.Todas as deleções testadas demonstraram reduzir a resposta de IFN-1 em células HEK239T e A549 transfectadas tanto ao nível do transcriptoma como ao nível da proteína.Curiosamente, os genes significativamente regulados negativamente nas deleções foram enriquecidos em “resposta de defesa ao vírus”, “replicação do genoma viral”, “regulação da transcrição pela RNA polimerase II” e “resposta ao interferon tipo I”.
Figura 5. Regulação negativa das vias de sinalização do interferon no mutante ∆500-532
Neste estudo, o impacto destas eliminações no vírus foi confirmado por estudos de infecção viral.Vírus com certos mutantes foram isolados de amostras clínicas e infectados em células Calu-3.Resultados detalhados do estudo da infecção viral podem ser lidos no artigo.
faça:10.1016/j.chom.2021.01.015
Referência
Lin J, Tang C, Wei H, et al.O monitoramento genômico do SARS-CoV-2 revela uma variante de deleção de Nsp1 que modula a resposta do interferon tipo I[J].Hospedeiro celular e micróbio, 2021.
Notícias e Destaques visa compartilhar os mais recentes casos de sucesso com Biomarker Technologies, capturando novas conquistas científicas, bem como técnicas proeminentes aplicadas durante o estudo.
Horário da postagem: 06/01/2022