Sequenciamento longo não codificado-Illumina
Vantagens do serviço
● Vantagens do serviço
● Específico de células e tecidos
● Estágio específico expressa e apresenta mudança de expressão dinâmica
● Padrões precisos de expressão de tempo e espaço
● Análise conjunta com dados de mRNA.
● Entrega de resultados baseada em BMKCloud: mineração de dados personalizada disponível na plataforma.
● Serviços pós-venda válidos por 3 meses após a conclusão do projeto
Requisitos de amostra e entrega
| Biblioteca | Plataforma | Dados recomendados | Controle de qualidade de dados |
| depleção de rRNA | Illumina PE150 | 10GB | Q30≥85% |
| Conc.(ng/μl) | Quantidade (μg) | Pureza | Integridade |
| ≥ 100 | ≥ 0,5 | DO260/280=1,7-2,5 DO260/230=0,5-2,5 Contaminação limitada ou inexistente de proteínas ou DNA mostrada no gel. | Para plantas: RIN≥6,5; Para animais: RIN≥7,0; 5,0≥28S/18S≥1,0; elevação limitada ou nenhuma elevação da linha de base |
Nucleotídeos:
Tecido: Peso (seco): ≥1g
*Para tecidos menores que 5 mg, recomendamos o envio de amostra de tecido congelado (em nitrogênio líquido).
Suspensão celular: Contagem de células = 3×107
*Recomendamos enviar lisado celular congelado.Caso a contagem de células seja menor que 5×105, recomenda-se o congelamento instantâneo em nitrogênio líquido.
Amostras de sangue:
PA×geneBloodRNATube;
6mLTRIzol e 2mL de sangue (TRIzol:Sangue=3:1)
Entrega de amostra recomendada
Recipiente: tubo de centrífuga de 2 ml (folha de estanho não é recomendada)
Rotulagem da amostra: Grupo+réplica, por exemplo, A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Envio:
1.Gelo seco: As amostras precisam ser embaladas em sacos e enterradas em gelo seco.
2.Tubos RNAstable: As amostras de RNA podem ser secas em tubo de estabilização de RNA (por exemplo, RNAstable®) e enviadas em temperatura ambiente.
Fluxo de trabalho de serviço
Projeto de experimento
Entrega de amostra
Extração de RNA
Construção de biblioteca
Sequenciamento
Análise de dados
Serviços pós-venda
Bioinformática
1. Classificação LncRNA
O LncRNA previsto pelos quatro softwares acima foi classificado em 4 categorias: lincRNA, LncRNA anti-sentido, LncRNA intrônico;sentido-LncRNA.A classificação do LncRNA foi mostrada no histograma abaixo.
Classificação LncRNA
2. Genes direcionados a cis da análise de enriquecimento de DE-lncRNA
O ClusterProfiler foi empregado na análise de enriquecimento GO em genes direcionados a cis de lncRNA diferencialmente expresso (DE-lncRNA), em termos de processos biológicos, funções moleculares e componentes celulares.A análise de enriquecimento GO é um processo para identificar termos GO significativamente enriquecidos direcionados a DEG em comparação com o genoma inteiro.Os termos enriquecidos foram apresentados em histograma, gráfico de bolhas, etc. conforme mostrado abaixo.
Genes direcionados a cis da análise de enriquecimento de DE-lncRNA - Gráfico de bolhas
3. Ao comparar o comprimento, número de exon, ORF e quantidade de expressão de mRNA e lncRNA, podemos entender as diferenças na estrutura, sequência e assim por diante entre eles, e também verificar se o novo lncRNA previsto por nós está em conformidade com as características gerais.
Caso BMK
Perfil desregulado de expressão de lncRNA em adenocarcinomas pulmonares de camundongos com mutação KRAS-G12D e nocaute P53
Publicados:Jornal de Medicina Celular e Molecular,2019
Estratégia de sequenciamento
Iluminar
Coleta de amostras
As células KP (shRNA-2) knockdown NONMMUT015812 e as células de controle negativo (sh-Scr) foram obtidas no dia 6 de uma infecção viral específica.
Principais resultados
Este estudo investiga os lncRNAs expressos de forma aberrante no adenocarcinoma de pulmão de camundongo com nocaute P53 e a mutação KrasG12D.
1,6424 lncRNAs foram expressos diferencialmente (alteração ≥ 2 vezes, P <0,05).
2. Entre todos os 210 lncRNAs (FC≥8), a expressão de 11 lncRNAs foi regulada por P53, 33 lncRNAs por KRAS e 13 lncRNAs por hipóxia nas células KP primárias, respectivamente.
3.NONMMUT015812, que foi notavelmente regulado positivamente no adenocarcinoma de pulmão de camundongo e regulado negativamente pela reexpressão de P53, foi detectado para analisar sua função celular.
4. O knockdown de NONMMUT015812 por shRNAs diminuiu a proliferação e a capacidade de migração das células KP.NONMMUT015812 era um oncogene potencial.
 Análise da via KEGG dos genes diferencialmente expressos nas células KP knockdown NONMMUT015812 |  Análise de ontologia genética dos genes diferencialmente expressos nas células KP knockdown NONMMUT015812 |
Referência
Perfil desregulado de expressão de lncRNA nos adenocarcinomas pulmonares de camundongos com mutação KRAS-G12D e nocaute P53 [J].Jornal de Medicina Celular e Molecular, 2019, 23(10).DOI: 10.1111/jcmm.14584
