METAGENOMIA
Kompletne, zamknięte genomy bakteryjne z mikrobiomów przy użyciu sekwencjonowania nanoporów
Sekwencjonowanie nanoporów |Metagenomika |MAG |Cyrkalizacja genomu bakterii |Mikrobiota jelitowa
Przegląd najważniejszych wydarzeń
1. W tym badaniu przedstawiono nowatorską metodę ekstrakcji długich fragmentów DNA, która pozwoliła na ekstrakcję mikrogramu czystego DNA o dużej masie cząsteczkowej, odpowiedniego do sekwencjonowania o długim odczycie, z 300 mg kału
2. W tym badaniu wprowadzono proces montażu, tokarkę, w którym MAG składano za pomocą długich odczytów i korygowano za pomocą krótkich odczytów.
3. Tokarkę oceniano na podstawie próbki mieszanki.7 z 12 bakterii udało się połączyć w pojedyncze kontigi, a 3 w cztery lub mniej kontigów.
4. Tokarkę następnie zastosowano do próbek kału, w wyniku czego wygenerowano 20 kolistych genomów, w tym Prevotella copri i kandydat Cibiobacter sp., które były znane z bogactwa ruchomych elementów genetycznych.
Główne osiągnięcie
Protokół ekstrakcji DNA HWM
Długoterminowe badania metagenomiczne jelit oparte na sekwencjonowaniu od dawna borykały się z trudnościami w ekstrakcji DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW) ze kału.W tym badaniu wprowadzono protokół ekstrakcji oparty na enzymach, aby uniknąć nadmiernego ścinania poprzez bicie kulkowe w tradycyjnych metodach.Jak pokazano na poniższym rysunku, próbki najpierw poddano działaniu koktajlu enzymów, w tym enzymu litycznego, MetaPolyzyme itp., aby zniszczyć ściany komórkowe.Uwolniony DNA ekstrahowano za pomocą układu fenol-chloroform, a następnie trawiono proteinazą K i RNazą A, oczyszczano na kolumnie i selekcjonowano wielkość SPRI.Metodą tą udało się uzyskać mikrogramy DNA HMW z 300 m stolca, co spełnia wymogi sekwencjonowania o długim odczycie zarówno pod względem jakości, jak i ilości.
Rysunek 1. Schemat ekstrakcji DNA HWM
Schemat przepływu tokarki
Jak opisano na poniższym rysunku, Lathe zawiera istniejący proces surowego procesu wywoływania bazowego przy użyciu Guppy.Następnie Flye i Canu oddzielnie wytwarzają dwa zespoły o długim odczytaniu, po czym następuje wykrywanie i usuwanie błędnych zespołów.Obydwa podzespoły są łączone za pomocą funkcji szybkiego scalania.Po połączeniu duże zespoły na poziomie megabazy są następnie sprawdzane pod kątem cyrkulacji.Następnie udoskonalanie konsensusu w sprawie tych zespołów odbywa się za pomocą krótkich odczytów.Ostatecznie złożone genomy bakteryjne są przetwarzane w celu ostatecznego wykrycia i usunięcia nieprawidłowego złożenia.
Rysunek 2. Schemat działania zespołu tokarki
Ocena tokarki z próbną mieszaniną bakterii
Do oceny działania platformy sekwencjonowania nanoporów i tokarki w zespole MAG zastosowano standardową mieszaninę 12 gatunków ATCC, zawierającą zarówno bakterie Gram-dodatnie, jak i Gram-ujemne.Platforma nanopore z N50 o wielkości 5,9 kb wygenerowała łącznie 30,3 Gb danych.Tokarka znacznie poprawiła montaż N50 od 1,6 do 4 razy w porównaniu z innymi narzędziami montażowymi o długim czytaniu i od 2 do 9 razy w porównaniu z hybrydowymi narzędziami montażowymi.Z 12 genomów bakteryjnych siedem złożono w pojedyncze kontigi (Rysunek 3. Circos z czarną kropką).Trzy kolejne połączono w cztery lub mniej kontigów, przy czym najbardziej niekompletny zestaw zawierał 83% genomu w jednym kontigu.
Rycina 3. Złożenia genomu w określonej mieszaninie bakterii składającej się z 12 gatunków
Zastosowanie tokarki w próbkach kału
Metodę tę następnie zastosowano do próbek ludzkiego kału w celu porównania identyfikacji organizmów i ciągłości składania z istniejącymi metodami, analizą w oparciu o chmurę odczytu i krótki odczyt.Z trzech próbek nowa ekstrakcja enzymatyczna dała co najmniej 1 μg na 300 mg masy wejściowej.Sekwencjonowanie nanoporów tego DNA HMW wygenerowało długie odczyty z N50 odpowiednio 4,7 kb, 3,0 kb i 3,0 kb.Warto zauważyć, że niniejsza metoda wykazała ogromny potencjał w wykrywaniu drobnoustrojów w porównaniu z istniejącymi metodami.Pokazano tutaj stosunkowo większą różnorodność alfa na poziomie gatunku w porównaniu z chmurą krótkiego odczytu i chmurą odczytu.Co więcej, tą metodą odzyskano wszystkie rodzaje z analizy krótkiego odczytu, nawet typowo oporne na lizę organizmy Gram-dodatnie.
Rysunek 4. Różnorodność alfa i składniki taksonomiczne określone metodami Nanopore, krótkiego odczytu i chmury odczytu
Tokarka zapewniała znacznie dłuższy czas pracy całego złożenia N50 niż montaż z krótkim odczytem i chmurą odczytu, pomimo od trzech do sześciu razy mniejszego wkładu surowych danych.Szkice genomów wytworzono metodą ciągłego binowania, podczas której wersje robocze sklasyfikowano jako „wysokiej jakości” lub „częściowe” na podstawie kompletności, zanieczyszczenia, pojedynczych kopii genów rdzeniowych itp. Składanie o długim odczycie wykazało znacznie większą ciągłość przy niższych kosztach w porównaniu do krótkiego czytania i czytania w chmurze.
Rysunek 5. Ciągłość montażu na organizm w każdej metodzie
Co więcej, obecne podejście do składania jest w stanie uzyskać zamknięte, koliste genomy.W próbkach kału zebrano osiem wysokiej jakości, jednokontigowych genomów, a pięć z nich osiągnęło precyzyjną cyrkulację.Długoterminowe podejście wykazało również imponującą zdolność rozwiązywania powtarzalnych elementów genomów.ObiegoweP. coprigenom wygenerowano za pomocą tego podejścia, o którym wiadomo, że zawiera wysoki stopień powtórzeń sekwencji.Najlepszy montaż tego genomu za pomocą chmury krótkiego odczytu i odczytu nigdy nie przekroczył N50 wynoszący 130 kb, nawet przy głębokości zasięgu 4800X.Te elementy o dużej liczbie kopii zostały w pełni rozwiązane poprzez podejście długiego odczytu, które często znajdowało się w krytycznych punktach zespołów z krótkim odczytem lub chmurami odczytu.W tym badaniu odnotowano inny zamknięty genom, który uważa się za członka niedawno opisanego genomuCibiobakterklad.W tym zamkniętym zestawie zidentyfikowano pięć domniemanych fagów o wielkości od 8,5 do 65,9 kb.
Rycina 6. Diagram Circos zamkniętych genomów P.copri i Cibiobacter sp.
Odniesienie
Moss, EL, Maghini, DG i Bhatt, AS (2020).Kompletne, zamknięte genomy bakteryjne z mikrobiomów przy użyciu sekwencjonowania nanoporów.Biotechnologia przyrody,38(6), 701-707.
Technologia i najważniejsze informacje ma na celu podzielenie się najnowszymi pomyślnymi zastosowaniami różnych technologii sekwencjonowania o dużej przepustowości w różnych obszarach badawczych, a także genialnymi pomysłami w projektowaniu eksperymentów i eksploracji danych.
Czas publikacji: styczeń 07-2022