MENNESKELIG GENOMI
naturgenetikk
Langlest sekvensering identifiserer gjentatte GGC-utvidelser i NOTCH2NLC assosiert med neuronal intranukleær inklusjonssykdom
ONT-resekvensering |Illumina |Hel exome-sekvensering |CRISPR-Cas9 ONT målrettet sekvensering |RNA-seq |ONT 5mC metylering kaller
Høydepunkter
1. Ved koblingsanalyse på en stor NIID-familie ble to koblede regioner identifisert.
2.ONT-basert langlest sekvensering og Cas-9-mediert berikelse ONT-sekvensering oppdaget en potensiell genetisk årsak til NIID, GGC gjentatte utvidelser i 5′ UTR av NOTCH2NLC.Denne studien rapporterte gjentatte utvidelser i menneskespesifikke gener for første gang som utviklet seg gjennom segmentelle duplikasjoner.
3.RNA-sekvensering avslørte unormale antisense-transkripter i begynnelsen eller inne i GGC-gjentatte ekspansjonsregioner i NOTCH2NLC.
Bakgrunn
Neuronal intranuclear inclusion disease (NIID) er en progressiv og dødelig nevrodegenerativ sykdom, som er preget av tilstedeværelsen av eosinofile hyalin intranukleære inneslutninger i sentrale og perifere nervesystemer.Dens svært varierende kliniske manifestasjoner gir store problemer med diagnostisering frem til introduksjon av hudbiopsi.Imidlertid lider histopatologibaserte metoder fortsatt av feildiagnostisering, noe som krever en genetisk forståelse av NIID.
Prestasjoner
Koblingsanalyse
Short-read sekvensering basert hele genom sekvensering (WGS) og hele eksom sekvensering (WES) ble utført på en stor NIID familie (13 berørte og 7 upåvirkede medlemmer).Koblingsanalyse på SNP-er ekstrahert fra disse dataene viste bare to koblede regioner: en 3,5 Mb-region ved 1p36.31-p36.22 (maksimal LOD=2.32) og en 58.1 Mb-region ved 1p22.1-q21.3 (maksimal LOD: 4.21 ).Imidlertid ble ingen patogene SNP-er eller CNV-er identifisert i disse koblede regionene.
GGC gjentatte utvidelser i NOTCH2NLC
Nanopore-basert sekvensering ble behandlet på 13 berørte og 4 upåvirkede medlemmer fra 8 familier (et annet berørt medlem ble sekvensert av Pacbio long read sekvenseringsplattform.).Langleste data avslørte sykdomsassosierte GGC-gjentatte utvidelser i 5′ UTR av NOTCH2NLC-genkartlegging til 58,1 Mb koblet region (figur 1).Disse gjentatte utvidelsene ble også identifisert i alle 40 sporadiske NIID-tilfeller testet med RP-PCR.
Cas-9-mediert målsekvensering på nanopore-plattform ble brukt for å oppnå høyere lesedekning på NOTCH2NLC-repetisjon (100 X-1795 X).Disse konsensussekvensene stemte godt overens med tidligere funn om gjentatte utvidelser av GGC.Dessuten ble {(GGA)n (GGC)n}n gjentakelser identifisert som en potensiell genetisk markør for svakhetsdominant fenotype (figur 2).
Figur 1. Sykdomsassosiert gjentatt ekspansjon identifisert på ekson 1 av NOTCH2NLC isoformer.
Figur 2. Konsensussekvenser av NPTCH2NLC-repetisjon hos NIID-pasienter med(*) eller uten svakhetsdominant fenotype
NOTCH2NL-gener er menneskespesifikke gener, som antas å spille en viktig rolle i menneskelig hjerneutvikling og nevrologiske sykdommer.Imidlertid ble tre NOTCH2-relaterte gener (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB og NOTCH2NLC) med >99,1% sekvensidentitet ikke løst før den siste menneskelige genomsammenstillingen.Syntesefri og langlest sekvensering på nanopore-plattformen har vist bemerkelsesverdige fordeler ved å løse regioner med høy likhet og (GGC)n-repetisjoner med 100 % GC-rik.
GGC gjentatte utvidelser i NOTCH2NLC
Transkriptomsekvensering ble behandlet på 2 berørte og 2 upåvirkede medlemmer.Normalisert lesedybde ble beregnet på sense- og antisense-tråder oppstrøms for første eksoner av NOTCH2NL-paraloger.Unormale anti-sense-transkripsjoner ble bare funnet i berørte tilfeller, som sitter i begynnelsen eller inne i den gjentatte ekspansjonsregionen (lilla topper i F1-14 og F1-16 i figur 3.).I tillegg ble 54 DEG identifisert og alle ble beriket i GO- og MPO-termer relatert til nevronale funksjoner.
Figur 3. Normalisert lesedybde oppstrøms for det første eksonet til NOTCH2NLC i upåvirkede (over) og berørte (under) tilfeller.
Teknologi
Oxford Nanopore Tekhnologies (ONT)
Nanopore-sekvensering skiller seg fra andre sekvenseringsplattformer ved at nukleotidene leses direkte uten DNA-synteseprosess.Når et enkeltstrengs DNA passerer gjennom en proteinpore (nanopore) i nanostørrelse, genererer forskjellige nukleotider forskjellige ioniske strømmer, som kan fanges opp og overføres til sekvenser av baser.ONT-sekvenseringsplattformen i seg selv viser ikke tilsynelatende teknisk grense for lengden på DNA-lesing.Derfor er ultralange avlesninger (ULR) tilgjengelige for genomsamling av høy kvalitet.Dessuten hjelper disse ekstremt lange lesingene, som er lange nok til å krysse komplekse sekvensfunksjoner eller strukturelle variasjoner, med å overvinne begrensningene ved kortlest sekvensering her.
Nanopore-sekvensering
Identifikasjon av strukturvariasjon (SV).
Syntesefri sekvensering bevarte i stor grad DNA-metyleringsinformasjon på mal.Metylerte A, T, C og G genererer distinkte ionestrømmer fra ikke-metylerte, som kan leses direkte av plattformen.Nanopore-sekvensering gir full-genomprofilering av både 5mC og 6mA ved enkeltnukleotidoppløsning.
Henvisning
Jun Sone, et.al.Langlest sekvensering identifiserer gjentatte GGC-utvidelser i NOTCH2NLC assosiert med neuronal intranukleær inklusjonssykdom.Naturgenetikk (2019)
Teknologi og høydepunkter tar sikte på å dele den siste vellykkede anvendelsen av forskjellige høykapasitets sekvenseringsteknologier på forskjellige forskningsarenaer, samt geniale ideer innen eksperimentell design og datautvinning.
Innleggstid: Jan-06-2022