TRANSKRIPTOMIKER
natur
KOMMUNIKASJONER
Full-lengde transkripsjonskarakterisering av SF3B1-mutasjon i kronisk lymfatisk leukemi avslører nedregulering av beholdte introner
Avskrifter i full lengde|Nanopore-sekvensering|Alternativ isoformanalyse
Bakgrunn
Somatiske mutasjoner i spleisefaktor SF3B1 har blitt rapportert mye å assosiere med ulike kreftformer, inkludert kronisk lymfatisk leukemi (CLL), uveal melanom, brystkreft, etc. I tillegg har kortleste transkriptomiske studier avslørt avvikende spleisemønstre indusert av SF3B1-mutasjoner.Imidlertid har studier på disse alternative skjøtemønstrene lenge vært begrenset til hendelsesnivå og mangel på kunnskap på isoformnivå på grunn av begrensningen av kortleste sammensatte transkripsjoner.Her ble nanopore sekvenseringsplattform introdusert for å generere full-lengde transkripsjoner, som muliggjorde inverstigation på AS isoformer.
Eksperimentelt design
Eksperimenter
Gruppering:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E-mutasjon);3. Normale B-celler
Sekvenseringsstrategi:MinION 2D-bibliotekssekvensering, PromethION 1D-bibliotekssekvensering;kortlest data fra samme prøver
Sekvenseringsplattform:ONT MinION;ONT PromethION;
Bioinformatisk analyse
Resultater
ENtotalt 257 millioner avlesninger ble generert fra 6 CLL-prøver og 3 B-celler.I gjennomsnitt ble 30,5 % av disse lesningene identifisert som full-lengde transkripsjoner.
Full-lengde alternativ isoformanalyse av RNA(FLAIR) ble utviklet for å generere et sett med høykonfidensisoformer.FLAIR kan oppsummeres som:
Nanopore leser justering: identifisere generell transkripsjonsstruktur basert på referansegenom;
Skorreksjon av skjøtekryss: korriger sekvensfeil (rød) med spleisested fra enten kommenterte introner, introner fra kortavleste data eller begge deler;
Collapse: oppsummer representative isoformer basert på skjøteforbindelseskjeder (førstegangssett).Velg isofrom med høy sikkerhet basert på antall støttende avlesninger (Terskel: 3).
Figur 1. FLAIR-analyse for å identifisere isoformer i full lengde assosiert med SF3B1-mutasjon i CLL
FLAIR identifiserte 326 699 spleisede isoformer med høy sikkerhet, hvorav 90 % er nye isoformer.De fleste av disse uannoterte isoformene ble funnet å være nye kombinasjoner av kjente skjøteforbindelser (142 971), mens resten av de nye isoformene inneholdt enten beholdt intron (21 700) eller nytt ekson (3594).
Long-read-sekvenser muliggjør identifikasjon av mutant SF3B1-K700E-endrede spleisesteder på isoform-nivå.35 alternative 3'SS'er og 10 alternative 5'SS'er ble funnet å være signifikant differensielt spleiset mellom SF3B1-K700E og SF3B1-WT.33 av de 35 endringene ble nylig oppdaget av langleste sekvenser.I Nanopore-data er fordelingen av avstanden mellom SF3B1-K700E-endrede 3'SS-er til topper på kanoniske steder rundt -20 bp, noe som er betydelig forskjellig fra en kontrolldistribusjon, tilsvarende det som er rapportert i kortavleste CLL-sekvenser.Isoformer av ERGIC3-genet ble analysert, hvor en ny isoform som inneholder det proksimale spleisestedet ble funnet mer rikelig i SF3B1-K700E.Både proksimal og distal 3'SS var assosiert med distinkte AS-mønstre som genererte flere isoformer.
Figur 2. Alternative 3′ skjøtemønstre identifisert med nanopore sekvenseringsdata
IR-hendelsesbruksanalyse har lenge vært begrenset i kortlest-basert analyse på grunn av tillit til IR-identifikasjon og kvantifisering.Uttrykk av IR-isoformer i SF3B1-K700E og SF3B1-WT ble kvantifisert basert på nanoporesekvenser, og avslørte en global nedregulering av IR-isoformer i SF3B1-K700E.
Figur 4. Landbruksintensitet og nettverkstilkobling på tvers av tre oppdrettssystemer (A og B);Tilfeldig skoganalyse (C) og Forholdet mellom landbruksintensitet og AMF-kolonisering (D)
Figur 3. Intronrentensjonshendelser er sterkere nedregulert i CLL SF3B1-K700E
Teknologi
Nanopore Long-read Sequencing
Nanopore-sekvensering er et enkelt molekyl i sanntid for elektrisk signalsekvenseringsteknologi.
Double-trådet DNA eller RNA vil binde seg til nanoporøst protein innebygd i biofilmen og avvikle under ledelse av motorprotein.
DNA/RNA-tråder passerer gjennom nanoporekanalprotein med en viss hastighet under påvirkning av spenningsforskjell.
Molecules genererer forskjellige elektriske signaler i henhold til kjemisk struktur.
Real-time deteksjon av sekvenser oppnås ved base calling.
Utførelse av transkriptomsekvensering i full lengde
√ Datametning
7 ganger færre avlesninger kreves for å oppnå sammenlignbar datametning.
√ Transkripsjonsstrukturidentifikasjon
Identifikasjon av forskjellige strukturelle varianter med konsensus i full lengde av hver transkripsjon
√ Differensialanalyse på transkripsjonsnivå - Avslører endringer som er skjult av kortlesninger
Henvisning
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Transkriptkarakterisering i full lengde av SF3B1-mutasjon ved kronisk lymfatisk leukemi avslører nedregulering av beholdte introner [J].Naturkommunikasjon.
Teknologi og høydepunkter tar sikte på å dele den siste vellykkede anvendelsen av forskjellige høykapasitets sekvenseringsteknologier på forskjellige forskningsarenaer, samt geniale ideer innen eksperimentell design og datautvinning.
Innleggstid: Jan-08-2022