RESEQUENTING AV HELE GENOMET
Genomisk overvåking av SARS-CoV-2 avdekker en Nsp1-slettingsvariant som modulerer type I interferonrespons
Nanopore |Illumina |Resekvensering av hele genomet |metagenomikk |RNA-Seq |Sanger
Biomarker Technologies ga teknisk støtte for prøvesekvensering i denne studien.
Høydepunkter
1.SARS-CoV-2 genomsekvensering og fylogenetisk analyse identifiserer 35 tilbakevendende mutasjoner inkludert 31 SNP-er og 4 Indels.
2. Assosiasjon med 117 kliniske fenotyper avslører potensielt
viktige mutasjoner.
∆500-532 i Nsp1 kodende region korrelerer med lavere viral
3.belastning og serum IFN-β.
4. Virale isolater med ∆500-532 mutasjon induserer lavere IFN-I
respons i de infiserte cellene.
Eksperimentelt design
Prestasjoner
1. COVID-19 epidemiologisk og genomisk overvåking
Kliniske data ble samlet inn i Sichuan-provinsen, Kina gjennom utbruddsperioden fra 22. januar 2020 til 20. februar 2020. Totalt 538 tilfeller av covid-19 ble bekreftet av qPCR-tester i Sichuan, hvorav 28,8 % var fra provinsen hovedstad.Bekreftede tilfeller i Sichuan økte eksponentielt, og nådde toppen 30. januar.Data støttet også at sosial distansering kan være en nøkkelfaktor for å forhindre spredning av virus.
Figur 1. Epidemiologisk studie av COVID-19 i Sichuan-provinsen, Kina
2. SARS-CoV-2 genomkonstruksjon og variantidentifikasjon
Med multipleks PCR-amplifikasjon etterfulgt av nanopore-sekvensering ble det generert totalt 310 nesten- eller delvis komplette genomer fra 248 pasienter med ca.80 % av genomene dekket av 10 avlesninger (Gjennomsnittlig dybde: 0,39 M avlesninger per prøve).
Figur 2. Frekvens av hver variant i Sichuan-kohorten
Totalt 104 SNP-er og 18 Indels ble identifisert fra SARS-CoV-2-genomer, hvor 31 SNP-er og 4 Indels ble identifisert som tilbakevendende genetiske varianter.Ved å sammenligne dem med 169 prøver fra Wuhan og med 81 391 høykvalitets offentlige genomsekvenser i GISAID, ble 29 av de 35 variantene funnet på andre kontinenter.Spesielt ble fire varianter inkludert ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 og T13243C bare funnet å være til stede i Sichuan og Wuhan og fraværende i GISAID-data, noe som indikerer at disse variantene var svært sannsynlig å bli impotert fra Wuhan, som oppfyller reisejournal over pasienter.
Evolusjonsanalyse med maksimal sannsynlighet (ML) metode og Bayesiansk molekylær klokke tilnærminger ble behandlet på 88 nye virus s fra Sichuan og 250 kuraterte genomer fra andre regioner.Genomer med ∆500-532 (Slettinger i Nsp1 kodende region) ble funnet spredt spredt i det fylogenetiske treet.Haplotypeanalyse på Nsp1-varianter identifiserte 5 av dem fra flere byer.Disse resultatene antydet at ∆500-532 fant sted i flere byer og kan bli importert flere ganger fra Wuhan.
Figur 2. Tilbakevendende genetiske varianter og fylogenetisk analyse i SARS-CoV-2-genomene
3. Sammenslutning av tilbakevendende genetiske varianter med kliniske implikasjoner
117 kliniske fenotyper var assosiert med alvorlighetsgrad av COVID-19, hvor 19 alvorlighetsrelaterte fenotyper ble klassifisert i alvorlige og ikke-alvorlige egenskaper.Forholdet mellom disse egenskapene og 35 tilbakevendende genetiske varianter ble viualisert i bi-cluster heatmap.En GSEA-lignende rangert anrikningsanalyse viste at ∆500-532 er negativt korrelert med ESR, serum IFN-β og CD3+CD8+ T-celletall i blodet.Dessuten viste qPCR-tester at pasienter infisert med virus som inneholder ∆500-532 hadde den høyeste Ct-verdien, dvs. lavest viral belastning.
Figur 3. Assosiasjoner av 35 tilbakevendende genetiske varianter med kliniske fenotyper
4. Validering på viral mutasjonsassosierte kliniske fenotyper
For å forstå virkningene av ∆500-532 på Nsp1-funksjoner, ble HEK239T-celler transfektert med plasmider som uttrykker full-lengde, WT Nsp1 og mutante former med delesjoner.Transkriptomprofiler for hver behandlede HEK239T-celle ble behandlet for PCA-analyse, noe som viste at delesjonsmutanter klynget seg relativt tettere og var signifikant forskjellig fra WT Nsp1.Genene som var signifikant oppregulert i mutantene var hovedsakelig beriket i "peptidbiosyntetisk/metabolsk prosess", "ribonukleoproteinkompleksbiogenese", "proteinmålretting til membran/ER", etc. Dessuten viste to delesjoner et distinkt ekspresjonsmønster fra WT.
Figur 4. Transkriptomanalyse på HEK239T-celler transfektert av WT Nsp1 og det med slettinger
Påvirkningen av slettinger på IFN-1-respons ble også testet i overuttrykt studie.Alle testede delesjoner ble vist å redusere IFN-1 repsonse i transfekterte HEK239T- og A549-celler på både transkriptomnivå og proteinnivå.Interessant nok ble de betydelig nedregulerte genene i delesjoner beriket i "forsvarsrespons på virus", "viral genomreplikasjon", "regulering av transkripsjon av RNA-polymerase II" og "respons på type I-interferon".
Figur 5. Nedregulering av interferon signalveier i ∆500-532 mutant
I denne studien ble virkningen av disse slettingene på virus ytterligere bekreftet av virusinfeksjonsstudier.Virus med visse mutanter ble isolert fra kliniske prøver og infisert til Calu-3-celler.Detaljerte resultater om virusinfeksjonsstudier kan leses i avisen.
gjør jeg:10.1016/j.chom.2021.01.015
Henvisning
Lin J, Tang C, Wei H, et al.Genomisk overvåking av SARS-CoV-2 avdekker en Nsp1-slettingsvariant som modulerer type I interferonrespons [J].Cellevert og mikrobe, 2021.
Nyheter og høydepunkter har som mål å dele de siste vellykkede tilfellene med Biomarker Technologies, fange nye vitenskapelige prestasjoner samt fremtredende teknikker brukt under studien.
Innleggstid: Jan-06-2022