Niet-referentiegebaseerde mRNA-sequencing-Illumina
Functies
● Onafhankelijk van welk referentiegenoom dan ook,
● De gegevens kunnen worden gebruikt om de structuur en expressie van transcripties te analyseren
● Identificeer variabele clipping-sites
Servicevoordelen
● Op BMKCloud gebaseerde levering van resultaten: Resultaten worden geleverd als gegevensbestand en interactief rapport via het BMKCloud-platform, dat gebruiksvriendelijk lezen van complexe analyseresultaten en aangepaste datamining mogelijk maakt op basis van standaard bio-informatica-analyses.
● After-sales services: After-sales services die 3 maanden geldig zijn na voltooiing van het project, inclusief projectopvolging, probleemoplossing, vragen en antwoorden over resultaten, enz.
Monstervereisten en levering
Voorbeeldvereisten:
Nucleotiden:
| Conc. (ng/μl) | Hoeveelheid (μg) | Puurheid | Integriteit |
| ≥ 20 | ≥ 0,5 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Beperkte of geen eiwit- of DNA-verontreiniging weergegeven op de gel. | Voor planten: RIN≥6,5; Voor dieren: RIN≥7,0; 5,0≥28S/18S≥1,0; beperkte of geen basislijnhoogte |
Weefsel: Gewicht (droog): ≥1 g
*Voor weefsel kleiner dan 5 mg raden wij aan om snel ingevroren (in vloeibare stikstof) weefselmonsters op te sturen.
Celsuspensie: celgetal = 3×107
*Wij raden aan om bevroren cellysaat te verzenden.In het geval dat het aantal cellen kleiner is dan 5×105wordt snel ingevroren in vloeibare stikstof aanbevolen.
Bloedstalen:
PA×genBloodRNATube;
6 mlLTRIzol en 2 ml bloed (TRIzol:Bloed=3:1)
Aanbevolen monsterlevering
Houder:
Centrifugeerbuisje van 2 ml (aluminiumfolie wordt niet aanbevolen)
Monsterlabeling: groeperen+repliceren, bijvoorbeeld A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Verzending:
1. Droogijs: monsters moeten in zakken worden verpakt en in droogijs worden begraven.
2.RNAstable buizen: RNA-monsters kunnen worden gedroogd in een RNA-stabilisatiebuis (bijv. RNAstable®) en bij kamertemperatuur worden verzonden.
Servicewerkstroom
Experimentontwerp
Levering van monsters
RNA-extractie
Bouw van bibliotheek
Volgorde aanbrengen in
Gegevensanalyse
After-sales diensten
Bio-informatica
1.mRNA(denovo) Assemblageprincipe
Bij Trinity worden lezingen gefragmenteerd in kleinere stukken, bekend als K-mer.Deze K-meren worden vervolgens gebruikt als zaden die kunnen worden uitgebreid tot contigs en vervolgens tot componenten op basis van contig-overlappingen.Tenslotte werd hier De Bruijn toegepast om transcripties in de componenten te herkennen.
mRNA (De novo) Overzicht van Trinity
2.mRNA (De novo) Verdeling van genexpressieniveau
RNA-Seq is in staat een zeer gevoelige schatting van genexpressie te maken.Normaal gesproken varieert het detecteerbare bereik van transcriptie-expressie FPKM van 10^-2 tot 10^6
mRNA (De novo) Verdeling van de FPKM-dichtheid in elk monster
3.mRNA (De novo) GO-verrijkingsanalyse van DEG's
De GO-database (Gene Ontology) is een gestructureerd biologisch annotatiesysteem dat een standaardvocabulaire van gen- en genproductfuncties bevat.Het bevat meerdere niveaus, waarbij hoe lager het niveau is, hoe specifieker de functies zijn.
mRNA (De novo) GO-classificatie van DEG's op het tweede niveau
BMK-zaak
Transcriptoomanalyse van het sucrosemetabolisme tijdens bolzwelling en -ontwikkeling bij uien (Allium cepa L.)
Gepubliceerd: grenzen in de plantenwetenschap，2016
Sequentiestrategie
Illumina HiSeq2500
Monsterverzameling
In dit onderzoek werd gebruik gemaakt van de cultivar Utah Yellow Sweet Spain “Y1351”.Het aantal verzamelde monsters was
15e dag na zwelling (DAS) van de bol (diameter 2 cm en gewicht 3-4 g), 30e DAS (diameter 5 cm en gewicht 100-110 g), en ~3 op de 40e DAS (diameter 7 cm en gewicht 260–300 gram).
Belangrijkste resultaten
1. in het Venn-diagram werden in totaal 146 DEG's gedetecteerd in alle drie de ontwikkelingsstadia
2. “Koolhydraattransport en metabolisme” werd vertegenwoordigd door slechts 585 unigenen (dwz 7% van de geannoteerde COG).
3. Unigenes die met succes in de GO-database zijn geannoteerd, werden geclassificeerd in drie hoofdcategorieën voor de drie verschillende stadia van de ontwikkeling van bollen.Het meest vertegenwoordigd in de hoofdcategorie “biologisch proces” was “metabolisch proces”, gevolgd door “cellulair proces”.In de hoofdcategorie ‘moleculaire functie’ waren de twee categorieën die het meest vertegenwoordigd waren ‘bindende’ en ‘katalytische activiteit’.
 Histogram van classificatie van clusters van orthologe groepen (COG). |  Histogram van genontologie (GO) -classificatie voor unigenen afgeleid van bollen in drie ontwikkelingsstadia |
 Venn-diagram dat genen toont die verschillend tot expressie komen in twee stadia van de ontwikkeling van uienbollen |
Referentie
Zhang C, Zhang H, Zhan Z, et al.Transcriptoomanalyse van het sucrosemetabolisme tijdens bolzwelling en ontwikkeling bij uien (Allium cepa L.) [J].Grenzen in Plant Science, 2016, 7: 1425-.DOI: 10.3389/fpls.2016.01425
