METAGENOMICA
Volledige, gesloten bacteriële genomen uit microbiomen met behulp van nanoporiesequencing
Nanopore-sequencing |Metagenomica |MAG's |Bacteriële genoomcircularisatie |Darmmicrobiota
Hoogtepunten
1. In dit onderzoek werd een nieuwe methode gepresenteerd om lange DNA-fragmenten te extraheren, die de extractie van microgram puur HMW-DNA opleverde dat geschikt is voor langgelezen sequencing uit 300 mg ontlasting
2. In dit onderzoek werd een assemblageworkflow, Lathe, geïntroduceerd, waarbij MAG's werden samengesteld door middel van lange leesbewerkingen en gecorrigeerd door korte leesbewerkingen.
3. Draaibank werd beoordeeld met een nepmengsel.Zeven van de twaalf bacteriën werden met succes samengevoegd tot enkele contigs en drie werden samengevoegd tot vier of minder contigs.
4. Draaibank werd verder toegepast op ontlastingsmonsters, wat 20 circulaire genomen genereerde, waaronder Prevotella copri en kandidaat Cibiobacter sp., die bekend stonden als rijk aan mobiele genetische elementen.
Belangrijkste prestatie
Extractieprotocol voor HWM-DNA
Long-read sequencing-gebaseerde darmmetagenomische onderzoeken hebben lange tijd last gehad van hardheid bij het extraheren van DNA met een hoog molecuulgewicht (HMW) uit ontlasting.In deze studie werd een op enzymen gebaseerd extractieprotocol geïntroduceerd om uitgebreide afschuiving door het kloppen van kralen bij traditionele methoden te voorkomen.Zoals weergegeven in de volgende afbeelding werden de monsters eerst behandeld met een cocktail van enzymen, waaronder lytisch enzym, MetaPolyzyme, enz. om de celwanden af te breken.Vrijgegeven DNA werd geëxtraheerd met behulp van een fenol-chloroformsysteem, gevolgd door digestie met proteïnase K en RNase A, op kolommen gebaseerde zuivering en selectie van SPRI-grootte.Deze methode slaagde erin om microgram HMW-DNA uit 300 m3 ontlasting op te leveren, wat zowel qua kwaliteit als kwantiteit voldoet aan de lang gelezen sequencing-eisen.
Figuur 1. HWM DNA-extractieschema
Schemastroom van draaibank
Zoals beschreven in de volgende afbeelding, bevat Lathe een bestaand proces van onbewerkt basecalling-proces met behulp van Guppy.Twee langgelezen assemblages worden vervolgens afzonderlijk door Flye en Canu geproduceerd, gevolgd door detectie en verwijdering van verkeerde montage.De twee subassemblages worden samengevoegd met quickmerge.Bij het samenvoegen worden grote samenstellen op megabasisniveau vervolgens gecontroleerd op circularisatie.Vervolgens wordt de consensusverfijning over deze vergaderingen verwerkt met korte lezingen.Uiteindelijk geassembleerde bacteriële genomen worden verwerkt voor de uiteindelijke detectie en verwijdering van verkeerde assemblage.
Figuur 2. Schemastroom van draaibankassemblage
Evaluatie van draaibank met nepbacteriënmengsel
Een standaard ATCC-mengsel van 12 soorten dat zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriën omvatte, werd gebruikt om de prestaties van het nanoporie-sequencingplatform en de draaibank bij MAG-assemblage te evalueren.Een totaal van 30,3 Gb gegevens werd gegenereerd door het nanoporieplatform met een N50 van 5,9 kb.Draaibank verbeterde de montage N50 aanzienlijk tot 1,6 tot 4 keer in vergelijking met andere langgelezen montagegereedschappen en 2 tot 9 keer in vergelijking met hybride montagegereedschappen.Van de twaalf bacteriële genomen werden er zeven samengevoegd tot enkele contigs (Figuur 3. Circos met zwarte stip).Drie andere werden samengevoegd tot vier of minder contigs, waarbij de meest onvolledige assemblage 83% van het genoom in één enkele contig bevatte.
Figuur 3. Genoomassemblages in een gedefinieerd bacteriemengsel van 12 soorten
Toepassing van draaibank in ontlastingsmonsters
Deze methode werd verder toegepast op menselijke ontlastingsmonsters om de identificatie van het organisme en de contiguïteit van de assemblage te vergelijken met bestaande methoden, op read-cloud en short-read gebaseerde analyses.Uit de drie betrokken monsters leverde de nieuwe, op enzymen gebaseerde extractie minstens 1 μg per 300 mg inputmassa op.Nanopore-sequencing van dit HMW-DNA genereerde long-reads met N50 van respectievelijk 4,7 kb, 3,0 kb en 3,0 kb.Met name blijkt dat de huidige methode een groot potentieel heeft op het gebied van microbiële detectie vergeleken met bestaande methoden.Hier werd een relatief hogere alfadiversiteit op soortniveau getoond vergeleken met short-read en read-cloud.Bovendien werden met deze methode alle geslachten uit short-read-analyses, zelfs typisch lyse-resistente Gram-positieve organismen, teruggevonden.
Figuur 4. Alfadiversiteit en taxanomische componenten bepaald door Nanopore-, short-read- en read-cloud-methoden
Draaibank leverde een veel langere N50 met volledige assemblage op dan assemblage met korte lees- en leeswolken, ondanks een drie tot zes maal lagere invoer van ruwe gegevens.Conceptgenomen werden geproduceerd door contig binning, waarbij de concepten werden geclassificeerd in "hoge kwaliteit" of "gedeeltelijk" op basis van volledigheid, besmetting, kerngenen met één kopie, enz. Lang gelezen assemblage vertoonde een veel hogere contiguïteit tegen lagere kosten vergeleken met naar short-read en read-cloud.
Figuur 5. Contiguïteit per organisme van elke methode
Bovendien is de huidige assemblagebenadering in staat gesloten, circulaire genomen op te leveren.In de ontlastingsmonsters werden acht hoogwaardige, single-contig genomen geassembleerd en vijf daarvan bereikten een nauwkeurige circularisatie.De lang gelezen aanpak toonde ook een indrukwekkend vermogen bij het oplossen van repetitieve elementen in genomen.GecirculeerdP. coprigenoom werd gegenereerd door deze aanpak, waarvan bekend is dat deze een hoge mate van sequentieherhaling bevat.De beste assemblage van dit genoom door short-read en read-cloud overschreed nooit de N50 van 130 kb, zelfs niet met een dekkingsdiepte van 4800X.Deze elementen met een hoog aantal kopieën werden volledig opgelost door middel van een lange-leesaanpak, die vaak werd aangetroffen op breekpunten van korte-lees- of lees-cloud-assemblages.In deze studie werd een ander gesloten genoom gerapporteerd, waarvan werd aangenomen dat het deel uitmaakte van onlangs beschrevenCibiobacterclade.In dit gesloten geheel werden vijf vermoedelijke fagen geïdentificeerd, variërend van 8,5 tot 65,9 kb.
Figuur 6. Circosdiagram van gesloten genomen van P.copri en Cibiobacter sp.
Referentie
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Volledige, gesloten bacteriële genomen uit microbiomen met behulp van nanoporiesequencing.Natuur biotechnologie,38(6), 701-707.
Technologie en hoogtepunten heeft tot doel de meest recente succesvolle toepassing van verschillende high-throughput sequencing-technologieën in verschillende onderzoeksarena's te delen, evenals briljante ideeën op het gebied van experimenteel ontwerp en datamining.
Posttijd: 07-jan-2022